基因表达（基因工程课件）

目的基因表达CONTENTS目录01载体的概念、种类02载体的条件、功能03质粒基因表达概念基因表达和调控特点原核与真核生物基因表达的主要差异04基因表达过程0503影响外源基因表达的因素蛋白质的表达形式基因表达：指基因携带的遗传信息，经过转录、翻译、加工修饰等复杂过程，产生具有生物学功能的蛋白质过程。基因表达是受调控的基因表达和调控特点一、时间和空间特异性时间特异性(temporalspecificity)：某一特定基因的表达严格按一定的时间顺序发生。空间特异性(spatialspecificity)：多细胞生物个体在特定生长发育阶段，同一基因在不同的组织器官表达不同。二、基因表达的方式存在多样性（一）基本/组成性基因表达：管家基因的表达水平受环境因素影响较小，在生物体各个生长阶段的大多数或几乎所有组织中持续表达。（二）诱导或阻遏表达有些基因的表达受到环境变化的影响诱导：在特定环境信号刺激下，相应基因的表达增强的过程。阻遏：在特定环境信号刺激下，相应基因的表达降低的过程。协同表达在一定机制控制下，功能相关的一组基因，无论其为何种表达方式，均需协调一致、共同表达。三、顺式作用元件和反式作用因子共同调节基因表达顺式作用元件：调节序列与被调控的基因位于同一条DNA链上。反式作用因子：调节序列远离被调控的基因，通过调节序列的表达产物来发挥调控作用，这些蛋白质分子称为反式作用因子。四、基因表达调控是个体生长、发育的基础通过调控基因表达，以维持细胞分化与个体发育。通过调控基因表达，使生物体表达相应的蛋白质，以适应环境，维持其生长和增殖。原核生物与真核生物基因表达的主要差异

原核真核基因连续不连续基因组小，闭合环状DNA分子大得多，染色质重复序列很少多编码基因/基因组大部分序列10%的序列mRNA多顺反子单顺反子遗传信息拟核DNA核DNA和线粒体DNA结构基因表达单位操纵子为单位排列原核细胞中几个结构基因常串联为一个转录单位，转录生成的mRNA可编码几种功能相关的蛋白质，称为多顺反子。真核mRNA只编码一种蛋白质，为单顺反子基因表达过程一、转录原核生物每一转录区段为一个转录单位，称为操纵子(operon)。操纵子包括若干个结构基因及其上游的调控序列。

启动子

操纵元件

调节基因结构基因调节基因：表达调控蛋白，与操纵元件结合，调控转录。启动子:是RNA聚合酶和各种调控蛋白作用的部位。共有序列:在转录起点上游-10及-35区域存在一些一致序列。-10区域：TATAAT，-35区域：为TTGACA

共有序列决定启动序列的转录活性大小。结构基因：转录产生的mRNA分子携带几个多肽链的编码信息

多顺反子。增强子：提高转录效率的顺式调控元件需要有启动子才能发挥作用与被调控基因位于同一条DNA链上是组织特异性转录因子的结合部位不仅能够在基因的上游或下游起作用，而且还可以远距离实施调节作用。沉默子：与特异蛋白因子结合时，对基因转录起阻遏作用。真核生物顺式作用元件：转录起始点上游有不同的DNA序列，这些序列的统称。顺式作用：蛋白质因子识别、结合自身基因的调节序列，调节自身基因的表达。反式作用：蛋白质因子，与另一基因的顺式作用元件作用，调节其表达。真核基因启动子：RNA聚合酶结合位点周围的一组转录控制组件，至少包括一个转录起始点以及一个以上的功能组件。TATA盒：起始点上游多数有共同的TATA序列。通常认为是启动子的核心序列。启动子上游元件：是位于TATA盒上游的DNA序列，多在转录起始点约-40～-100nt的位置，比较常见的是GC盒和CAAT盒。转录起始原核生物：RNA聚合酶和启动子结合，启动RNA合成。RNA聚合酶全酶(2)与模板结合，形成闭合转录复合体。

DNA双链局部解开，形成开放转录复合体。在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应，形成转录起始复合物。真核生物：转录起始需要启动子、RNA聚合酶和转录因子的参与。真核生物RNA-pol不与DNA分子直接结合，而需依靠众多的转录因子，形成转录起始复合物。转录调节蛋白又称转录调节因子/转录因子/反式作用蛋白/反式作用因子，进入细胞核，调节相应基因的转录。转录延长：启动子清除，σ亚基脱落，RNA聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移，在核心酶作用下NTP不断聚合，RNA链不断延长。原核生物：在同一DNA模板上，有多个转录同时进行（羽毛状现象），转录尚未完成，翻译已在进行。真核生物：转录延长过程与原核生物大致相似，但因有核膜相隔，没有转录与翻译同步的现象。αβωαβ’σ核心酶全酶转录终止：RNA聚合酶在DNA模板上不再前进，转录产物从转录复合物上脱落下来。原核生物依赖ρ因子的转录终止：ρ因子能与转录中的RNA结合,启动ρ因子ATP酶活性,并向RNA的3’端滑动,划至RNA聚合酶附近时,RNA聚合酶暂停聚合活动,停止转录。非依赖ρ因子的转录终止：模板DNA在转录终止点附近有特殊核苷酸序列，可以形成颈环结构，影响RNA聚合酶的构象，使转录终止。真核生物：转录终止修饰点：在读码框下游常有一组公共序列AATAAA及GTGTGT序列在超出读码框千百个核苷酸后停顿，进行转录后修饰。mRNA在AATAAA序列和序列GTGTGT间断裂。加多聚腺苷酸（polyA）尾巴结构。原核生物真核生物转录对比：二、翻译以mRNA分子为模板，以tRNA为运载工具，以20种氨基酸为原料，在核糖体内生成相应的氨基酸序列的过程。核糖体：蛋白质生物合成的场所，在细胞质和线粒体中核糖体：rRNA和蛋白质，直径为20-25nm,真核细胞的核糖体比原核细胞的大。一)氨基酸的活化氨基酸的活化：氨基酸与特异tRNA结合形成氨基酰-tRNA的过程。原核生物：起始氨基酰-tRNA:

fMet-tRNAfMet

真核生物：起始氨基酰-tRNA:

Met-tRNAiMet参与肽链延长的甲硫氨酰-tRNA：Met-tRNAMet二)肽链合成起始:原核生物30s小亚基与mRNA模板相结合再与fMet-tRNAfMet结合最后与50s大亚基结合真核生物40s小亚基首先与Met-tRNAiMet结合再与模板mRNA结合最后与60s大亚基结合生成起始复合物核糖体结合位点（RBS）----SD序列mRNA上与核糖体16sRNA结合的序列。原核生物肽链合成的延长：进位:

氨基酰-tRNA结合到核糖体A位。2.成肽:转肽酶催化，P位上起始氨基酰-tRNA上的氨基酸与A位上氨基酰-tRNA的氨基形成肽键。3.转位：转位酶催化，A位的肽酰-tRNA移入P位。PAGGACAAACUAGGUUCCUGCUAG氨基酸1氨基酸2肽链合成终止核糖体A位出现mRNA的终止密码子后，多肽链合成停止，肽链从肽酰-tRNA中释出，mRNA、核蛋白体大、小亚基等分离。原核生物：终止阶段需要释放因子RF-1、RF-2和RF-3参与，识别终止密码子等功能真核生物：翻译终止过程与原核生物相似，但只有1个释放因子eRF。三、翻译后修饰前体蛋白是没有活性的，常常要进行一个系列的翻译后加工，才能成为具有功能的成熟蛋白。蛋白质翻译后修饰过程使蛋白质结构更为复杂，功能更为完善，调节更为精细，作用更为专一。蛋白质行使正常生理功能所必需的。原核生物切除：切除N端甲酰甲硫氨酸和信号肽（多肽进入质膜需借助信号肽）糖基化：原核生物也存在糖基化；甲基化：较普遍，受体蛋白磷酸化：过程可逆，在细菌的趋化性和氮代谢过程中存在；乙酰化：组蛋白、DNA结合蛋白、乙酰辅酶A合成酶、核糖体蛋白；类泛素化：类泛素蛋白存在，标记蛋白并酶解蛋白真核生物切除：切除N端甲硫氨酸、信号肽、部分肽链（无活性

活性）；糖基化：普遍；羟基化：胶原蛋白、弹性蛋白磷酸化：过程可逆，涉及所有生理和病理过程（信号转导、肿瘤发生等)；脂酰化：与脂类共价连接，与生长调节、形态发生等甲基化：赖氨酸、精氨酸上；乙酰化：组蛋白乙酰化促进转录，去乙酰化抑制转录；二硫键形成：分泌蛋白、膜蛋白泛素化：所有真核细胞的调控系统，对蛋白质特异性水解影响外源基因表达的因素起始密码子及其后续若干密码子的影响1、起始tRNA可同时识别AUG、GUG和UUG三种起始密码子2、但识别频率不同，GUG=50%AUG；UUG=25%AUG3、从AUG开始的前几个密码子不能与mRNA的5’端非编码区形成茎环结构，否则干扰mRNA在核糖体上的准确定位。密码子密码子生物体对密码子的偏爱性→使用频率不同影响偏爱性的决定因素:1生物基因组中的碱基含量3细胞内tRNA的含量密码子偏爱性对大肠杆菌中基因表达的影响原核生物和真核生物的密码子使用频率具有较大差异两种方法可提高外源基因在大肠杆菌中表达：根据密码子偏爱性合成外源基因同步表达基因表达所需的tRNA质粒拷贝数

表达型质粒在受体细胞中拷贝数可达数百至上千个质粒扩增通常发生在细胞的对数生长期对数生长期：细胞代谢最旺盛质粒过度增殖目的基因的高效表达

解决方法：控制重组质粒扩增影响受体细胞生长代谢重组质粒不稳定基因表达水平下降蛋白质的表达形式包涵体型异源蛋白的表达分泌型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达整合型异源蛋白的表达包涵体型异源蛋白的表达包涵体及其性质在一定条件下，大肠杆菌能积累某种生物大分子。生物大分子致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体。包涵体形式的蛋白质常丧失理化特性和生物学功能。包涵体中还含有少量的DNA、RNA和脂多糖等非蛋白分子。包涵体形式表达蛋白质的优缺点：表达产物的分离简单优点：包涵体水溶性差，密度大，菌体裂解后，通过高速离心可将重组蛋白从细菌裂解物中分离。一定程度上保持表达产物的结构受体细胞的蛋白酶基本无法降解包涵体内的蛋白质。包涵体表达形式的缺点：包涵体内的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过有效的变性、复性操作，才能得到具有正确空间构象（具有生物活性）的目标蛋白质。分泌型异源蛋白的表达表达的异源蛋白，通过运输或分泌方式定位于细胞周质,穿过外膜进入培养基中。蛋白质产物N端信号肽序列的存在是蛋白质分泌的前提条件。外膜内膜分泌形式表达目的蛋白的优缺点优点：蛋白质稳定性高。蛋白质易于分离。蛋白质末端完整：真核生物蛋白质N端不含甲硫氨酸残基★大肠杆菌中表达的蛋白质，N端甲硫氨酸残基不能被切除将外源基因与大肠杆菌的信号肽序列重组，分泌表达后蛋白质N端甲硫氨酸残基在信号肽剪切过程中被有效除去。分泌表达形式的缺点：★大肠杆菌的蛋白质分泌机制不健全。★外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌表达★少数外源基因既便能分泌表达，但表达效率比包涵体方式低很多。融合型异源蛋白质表达★外源基因与受体细胞自身的蛋白质编码基因拼接在一起，由这种杂合基因表达的蛋白质称为融合蛋白。★在融合蛋白中，受体细胞的蛋白质位于N端，异源蛋白质位于C端。★通过引入的蛋白酶切割位点或化学试剂特异性断裂位点，从融合蛋白质中释放出目的蛋白质。受体蛋白基因目的蛋白基因酶切位点或断裂位点融合形式表达目的蛋