超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱仪联用技术对紫花杜鹃中黄酮类成分的分析

超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱仪联用技术对紫花杜鹃中黄酮类成分的分析

紫草杜鹃是杜鹃科植物的紫草杜鹃rhododinronatahe断面的干燥叶片和叶柄。味微辛,性微温,具有止咳、祛痰功能,临床上用于慢性气管炎,咳嗽痰多等症。据文献报道紫花杜鹃中的化学成分有挥发油、黄酮类、三萜类等,其中发挥止咳祛痰作用的活性物质为黄酮类成分,包括槲皮素、槲皮苷、金丝桃苷等10余种成分。由于《中国药典》及卫生部颁布的中药标准均无紫花杜鹃药材的鉴别及含量测定方法,使得市售紫花杜鹃的品种混乱,质量千差万别,从而影响了紫花杜鹃的有效利用。UPLC/Q-TOF-MS技术是目前科学研究中应用较好的定性测定方法,UPLC是较先进的液相色谱技术,具有超高压、超高灵敏度、超高分离度等特点,Q-TOF-MS是高分辨串联质谱,其显著特点是灵敏度高和选择性强,得到的质谱图数据完整且品质高,可以测得化合物准确分子质量。该实验通过UPLC/Q-TOF-MS对紫花杜鹃中黄酮类成分进行快速分析,为中药的质量评价及研究提供有价值的参考。1数据采集与处理美国WatersACQUITYUPLC/Q-TOF-MS系统,采用电喷雾电离(ESI),二元高压泵、在线脱气装置、自动进样器、柱温箱和TUV检测器。数据采集与处理采用Masslynx4.1软件。甲醇为色谱纯(美国,TEDIA公司),甲酸为色谱纯(美国,DIMA公司),水为超纯水器所制(德国,Sartorius公司)。金丝桃苷(批号111521-200303)、异槲皮苷(批号111538-200403)、槲皮素对照品(批号0081-9304),均购自中国药品生物制品检定所。紫花杜鹃药材采自广西以及广东的罗定、清远、高要等地,经广东药学院生药学教研室鉴定为紫花杜鹃R.mariae的干燥叶和带叶嫩枝。2方法2.1粗粉的提取取紫花杜鹃药材粉碎过24目筛,称取1g粗粉于锥形瓶中,加入甲醇25mL,加热回流提取30min,放置室温过滤,过0.22μm微孔滤膜,即得。2.2对照品溶液的制备精密称取金丝桃苷对照品10.05mg、异槲皮苷对照品10.05mg、槲皮素对照品10.19mg,加甲醇分别配成为50.25,50.25,20.38μg·L-1的对照品溶液。2.3色谱-质谱条件流动相0.1%甲酸水溶液(A)-甲醇(B);梯度洗脱,0～34min,30%B;34～36min,30%～35%B;36～50min,35%B;50～52min,35%～45%B;52～75min,45%B。进样量为10μL,流速为1.0mL·min-1;检测波长360nm;柱温30℃。WatersACQUITYUPLCBEHC18色谱柱(2.1mm×50mm,1.7μm),流动相0.1%甲酸水溶液(A)-甲醇(B);梯度洗脱,0～1min,20%B;1～5min,20%～30%B;5～6min,30%B;6～6.2min,30%～35%B;6.2～8min,35%B;8～10.5min,35%～45%B;10.5～12min,45%B;12～12.5min,45%～20%B。进样量为2μL,流速为0.3mL·min-1;检测波长360nm;柱温30℃。2.4子源参数电导气LC-MS系统使用ESI离子源,在正离子模式与负离子模式下分别采集数据。数据采集范围m/z150～500。离子源参数ESI:Samplecone30V,气化室温度350℃,离子源温度100℃,雾化气(N2)体积流量50L·h-1,脱溶剂气(N2)体积流量500L·h-1。LockMass为5-羟基-7-(4-羟基-3-甲氧苯基)-1-苯-3-庚酮,[M+H]+329.1753,[M-H]-327.1596。3质谱组成的分析以0.1%甲酸水溶液-甲醇为流动相进行线性梯度洗脱,UPLC和HPLC均可得到较好的分离效果,见图1。紫花杜鹃中的黄酮类化合物极性相对较大且具热不稳定性,因此使用ESI离子源;其分子中的羟基容易形成稳定的氧负离子,故用负离子模式检测所得总离子流图(TIC)有较好的信噪比。质谱正、负离子模式的总离子流图与360nm波长下紫外色谱图基本吻合,但总离子流图的基线噪声较大。随后又对紫外色谱图中出现的色谱峰分别进行正、负离子的二级质谱的研究。根据正、负离子模式的一级质谱的分子离子峰得到化合物的准确分子量,计算出其元素组成,结果见表1。再由正、负离子的二级质谱中碎片信息,结合文献,对紫花杜鹃UPLC分离出的7个主要峰进行分析,推断出其可能的结构,结果见表2。4讨论4.1hplc-q-tof-ms分析该实验采集了8批不同来源及产地的紫花杜鹃药材,在相同的流动相和检测波长下分析各个样品,HPLC图上各批药材中主要的色谱峰大致相同,其中的3个色谱峰分别与金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素对照品的出峰时间一致,初步判断药材中含有上述3种黄酮类化合物,且以罗定的紫花杜鹃样品色谱峰更为明显,从而选取其作为代表性的样品进行UPLC/Q-TOF-MS分析。4.2但是，文本的定义4.3各化合物的色谱及质谱特征黄酮苷类化合物的糖基多结合在3,5,7-位及3′,4′,5′-位,依据正、负离子的二级质谱碎片峰信息,推定其结构关系,结合黄酮类裂解规律并与对照品比较,最终推定化合物结构。可以得到以下结果,见图2(以正离子模式为例)。化合物1Q-TOF-MS给出准分子离子峰m/z481.0965[M+H]+,319.0为失去1个葡萄糖基的杨梅素苷元碎片的离子峰[(M+H)-162]+,结合文献推断为杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷。化合物2Q-TOF-MS给出准分子离子峰m/z451.0855[M+H]+,319.0为失去1个木糖的杨梅素苷元碎片的离子峰[(M+H)-132]+,结合文献推断为杨梅素-3′-O-β-D-吡喃木糖苷。化合物3Q-TOF-MS给出准分子离子峰m/z465.1048[M+H]+,303.0为失去1个半乳糖的槲皮素苷元碎片的离子峰[(M+H)-162]+,结合文献推断为槲皮素-3-O-半乳糖苷,即金丝桃苷,且与对照品数据一致。化合物4Q-TOF-MS给出准分子离子峰m/z465.1010[M+H]+,303.0为失去1个葡萄糖基的槲皮素苷元碎片的离子峰[(M+H)-162]+,结合文献推断为槲皮素-3-O-葡萄糖苷,即异槲皮苷,且与对照品数据一致。化合物5Q-TOF-MS给出分子离子峰m/z435.0946[M+H]+,303.0为失去1个阿拉伯糖基的槲皮素苷元碎片的离子峰[(M+H)-132]+,结合文献推断为槲皮素-3-O-阿拉伯糖苷,即广寄生苷(萹蓄苷)。化合物6Q-TOF-MS给出准分子离子峰m/z449.1067[M+H]+,303.0为失去1个鼠李糖基的槲皮素苷元碎片的离子峰[(M+H)-146]+,结合文献推断为槲皮素-3-O-鼠李糖苷,即槲皮苷。化合物7Q-TOF-MS给出准分子离子峰m/z303.0510[M+H]+,结合文献推断为槲皮素,且与对照品数据一致。在紫花杜鹃提取液水解之后的HPLC图可见几个主要的色谱峰全都消失,变成只有1个与槲皮素对照品的位置一致的色谱峰,也证实了紫花杜鹃药