中药有效成分的药效学研究

中药有效成分的药效学研究

服药是中医学的特点，主要指寒、热、热、冷。这是中医复杂疗效的高度概括。中药有效成分的分离、提取、研发是中药学发展的重要方向,而伴随的关键性基础问题之一是如何判断其药性,以及是否与其药材的药性一致。因此探索和建立中药有效成分药性的检测方法十分必要。近几年,常用实验动物大鼠和小鼠标准化、计量化证候检测方法的建立,以及证候动物模型的发展,给中药及中药有效成分药性的检测提供了方法。本研究探索并采用优甲乐热证造模及小鼠计量化诊法和辨证方法,同步检测比较小檗碱等7味中药有效成分与其对应的黄柏等6味中药饮片药性,探索建立中药有效成分药性实验检测与评价的方法。1材料表面1.1设定52采用清洁级雄性昆明小鼠,体质量(25±2)g,共204只。由中科院上海实验动物中心提供,合格证号:SCXK(沪)2003-0003。1.2河北知母、充放电型①道地中药饮片药材:一次性购自上海康桥中药饮片有限公司(许可证:沪Y20060185),产地:河北知母、四川黄柏、广西生栀子、甘肃生大黄、广西苦参、山西生黄芪、辽宁生晒参、山西淫羊藿、四川制附子、四川制吴茱萸等。②中药有效组分:菝契皂苷元、小檗碱、栀子苷、大黄酚、大黄素、淫羊藿苷、乌头碱等,均购自上海西宝生物技术有限公司。1.3口药品注册号优甲乐(MerckKGaA,进口药品注册证号:H20090234);其它试剂(乙醚、丙酮、乙醇、生理盐水)购自国药集团化学试剂有限公司。2方法2.1黄酚、大黄素、平均的生物量第1批实验:设正常、模型对照、黄柏、小檗碱、大黄、大黄酚、大黄素、附子组。共计8组,每组96只。第2批实验:设正常、模型对照、栀子、栀子苷、知母、知母苷、淫羊藿、淫羊藿苷、乌头碱组。共计9组,每组108只。2.2药汁浓缩组采用1g生药/1l的方法取知母、黄柏、生栀子、生大黄、苦参、生黄芪、生晒参、淫羊藿、制附子、制吴茱萸等10味中药饮片各100g。用自来水1∶10浸没2h,武火煮沸后,文火保持微沸30min,取药汁,趁热抽滤;药渣中加入6倍自来水,武火煮沸后,文火保持微沸20min,取药汁,趁热抽滤;合并2次滤液,80℃恒温水浴锅浓缩至1g生药/1ml的浓度。倒入无水乙醇,与药汁比例为2∶1,4℃冰箱过夜,48h后悬蒸醇提,每味中药饮片得到1g生药/ml的药汁各100ml。4℃储存备用。根据《中国药典》2005年版记载,(见表1)各有效组分用相应的助溶剂助溶,再根据生药中单体的含量比例,用纯净水调整药物浓度配制成相当于1g中药生药/ml的浓度。2.3优甲乐内经综合征型小鼠模型优甲乐小鼠实热证候模型:优甲乐片混悬液3.75μg/10g,一次灌胃给药。2.4小鼠的用药量小鼠用药剂量依据主要成分的得率换算至成人每千克体质量的20倍。调整药物浓度如下:黄柏、栀子、苦参、生晒参、制附子、生大黄、淫羊藿、知母等稀释至0.1666g/ml,灌胃0.5ml,每只小鼠每天的用药量为0.0833g;生黄芪稀释至0.3332g/ml,灌胃0.5ml,每只小鼠每天的用药量为0.1666g;制吴茱萸稀释至0.0833g/ml,灌胃0.5ml,每只小鼠每天的用药量为0.0416g。正常组和模型对照组则灌以等量的生理盐水。2.5小鼠体内红外热像检测①数字WMY-01型温度计,检测腋温。②ThermaCAMP30红外热像仪,检测小鼠体表红外热像;采用配套软件提取眼温和尾根部温:取头侧眼部区域最高温度、取背延长线与尾根部中线交汇点温度,具体定位见图1。③综合温度:综合温度=腋温×70%+眼红外×20%+尾红外×10%。2.6小鼠时间点的检测根据造模以及中药药代动力学文献,每只小鼠时间点如下:首次红外、腋温检测后,0h造模给药,1h中药及有效组分给药;3h给药后红外、腋温检测。2.7大学生的反应各批次所有小鼠检测值与对应的正常组均数比值,得到试验前t1和试验后t2两组检测比值;t2/t1值系受试小鼠对给药药性的反应。应用SPSS15.0统计软件,采用单向方差分析,求出对应各组t2/t1的均数和误差,进行多个样本均数比较和样本均数间的比较以此说明各个用药组的差异。当对数据进行Fisher方差分析时,如果发现Levene检验方差不齐,则选择了方差不齐的近似F检验Welch法和Brown-Forsythe法对F值和自由度进行校正,而后进行方差分析。3结果3.1大黄素-明目酚、天麻酚、麻黄①优甲乐造模后3h,与正常对照组相比,小鼠腋温接近正常对照组(见图2～3)。与优甲乐造模组相比。②黄柏、小檗碱给药后腋温下降(P<0.05),性寒。③大黄、大黄素给药后腋温下降(P<0.05),大黄酚呈下降趋势,三者药性一致,性寒,程度存在差异。④附子(图2)给药后腋温有下降趋势,未见热性表现;而乌头碱(见图3)腋温反而大降(P<0.05),系毒性反应。⑤栀子、栀子苷给药后腋温下降(P<0.05),两者药性一致,性寒(见图3)。⑥知母、知母皂苷给药后腋温下降(P<0.05),两者一致,性寒。⑦淫羊藿和淫羊藿苷给药后对腋温的影响不大。3.2不同组分的对药单优甲乐造模后3h,与正常对照组相比,小鼠眼红外温下降(P<0.05)或有下降趋势(见图4～5)。与优甲乐造模组相比:黄柏和小檗碱、大黄和大黄素及大黄酚、栀子和栀子苷、知母和知母皂苷,以及附子等给药后没有显著的改变。乌头碱(见图5)眼红外测温值有下降趋势,系毒性反应。淫羊藿和淫羊藿苷(见图5)眼红外测温值升高(P<0.05),或具有升高趋势,提示药性偏热。3.3不同试剂对乐造组分毒性的影响优甲乐造模后3h,与正常对照组相比,小鼠尾红外测温改变不明显(见图6～7)。与优甲乐造模组相比:黄柏和小檗碱、大黄和大黄酚尾温有下降趋势,大黄素下降(P<0.05),性寒。栀子和栀子苷、知母和知母皂苷没有显著的改变。乌头碱尾温下降(P<0.05),系毒性反应(见图7)。淫羊藿和淫羊藿苷尾温升高(P<0.05),药性偏热(见图7)。3.4小碱、天麻酚、大黄素p>0.05和栀子苷、知母皂苷p1优甲乐造模后3h,小鼠综合体温接近正常对照组(见图8～9)。与优甲乐造模组比较:黄柏、大黄与大黄素(P<0.05)下降,小檗碱、大黄酚有下降趋势,性寒(见图8)。栀子苷和栀子、知母和知母皂苷均有下降趋势,性偏寒(见图9)。乌头碱下降(P<0.05)系毒性反应。淫羊藿苷升高(P<0.05),淫羊藿有升高趋势,药性热(见图9)。4讨论4.1中药用药的确定中药有效成分提取是中药制剂发展的方向,伴随的主要问题之一是所提取的中药有效成分是否具有药性,药性是否与原药材一致,一味中药所含有的多种有效成分,其药性是否一致,能不能代表原药材?如果药性不明确,是否还能视为中药?这些问题悬而未决,将影响中药现代化、中药创新药物的研发。因此,借鉴历史上中药药性判断的方法,建立标准化中药有效成分、中药饮片等药性实验检测方法十分必要。4.2代动力学检测基于临床上甲亢患者具有热证或低热表现实验采用甲状腺素制作热证模型已多有报道。利用优甲乐造模小鼠代谢加快的特点,将有助于判断寒热中药药性的作用。我们的预实验发现,优甲乐混悬液灌胃后,小鼠体温轻度下降,至灌胃3h会出现一过性体温回升,接近或略超过正常水平,与优甲乐药代动力学检测其血T4峰值水平出现于服药后2～4h一致。因此,选择优甲乐混悬液灌胃后3h作为检测时间点。4.3灌胃给药后最大吸收峰有关药代动力学文献表明,本实验所选用中药及其主要成分,灌胃给药后最大吸收峰多在1h左右,2h可广泛分布于各组织中。因此,选择中药有效成分和中药灌胃给药后2h作为检测时间点。4.4综合温度:主要分为3.腋温检测体表温度。体表温度是受试者寒热感受的主要依据,而且腋温检测方法相对稳定;从本实验的结果看,腋温的改变也最符合被检中药的药性。眼红外所采集的眼温,反映体内温度,相对恒定,变化幅度小。尾红外采集的尾根部温度,系体表温度,但易受测距的小幅改变、环境温度等因素的影响,稳定性较差。因此,综合温度采用腋温×70%权重、眼红外×20%权重,以及尾红外×10%的权重;四诊合参,可以作为判断药性的一个综合性指标。4.5中药饮片的热性能本实验表明,选用中药饮片黄柏、大黄、栀子、知母、淫羊藿等所检测出的药性与大多中药文献描述一致,证明本方法是可行的;一些中药有效成分与中药饮片的药性一致,如小檗碱与黄柏、大黄素和大黄酚与大黄、