2022分子体外诊断检验冷冻组织检验前过程的规范第3部分：分离DNA

分子体外诊断检验冷冻组织检验前过程的规范第3部分：分离DNAII目 次前 言 II引 言 III范围 4规范性引用文件 4术语和定义 4总则 8实验室外部 8实验室内部 10PAGEPAGE103DNA范围DNA本文件适用于医学实验室和分子病理实验室对冷冻组织中提取的蛋白质进行的分子体外诊断检验，本文件不包括冷冻前经过化学稳定预处理的组织。注：国际、国家或地区法规或要求同样能适用于本文件所涵盖的特定内容。规范性引用文件（包括所有的修改单适用于本文件。GB/T22576.1-2018医学实验室质量和能力的要求第1部分：通用要求（ISO15189:2012，IDT）术语和定义ISO15189界定的以及下列术语和定义适用于本文件。ISO和IEC维护的用于标准化的术语数据库，地址如下：—— ISO/obp上获得。——IEC电子百科：可在/上获得。3.1等分样品aliquot假定取样误差忽略不计时，大量均质物质的一部分。注1：该术语通常适用于液体。组织是异质的，所以不能等分。注2：该定义源于第[22],[23],[24]条参考文献。3.2环境温度ambienttemperature未经调节的周围空气的温度。3.3分析物analyte被测量名称所代表的组分。[来源：GB/T21415-2008,3.2，有修改]3.4分析检测性能analyticaltestperformance测量待测分析物的检验的准确度、精密度和灵敏度。注：也能适用于其他试验性能特性，比如稳健性、重复性等。3.5生物样本库biobanking3.6冷缺血coldischemia组织自人体取出后至稳定或固定前的存在状况。3.7诊断diagnosis从其体征和/或症状中识别健康或疾病状态，诊断过程能通过各种检验对个体状况进行分类，分成不同的类别或亚类，以便做出关于治疗和预后的医学决策。3.8DNA脱氧核糖核酸deoxyribonucleicacid以双链或单链形式存在的脱氧核糖核苷酸聚合体。[SOURCE:ISO22174:2005,3.1.2][来源：SN/T2102.1-2008,3.1.2]3.9DNAase脱氧核糖核酸酶deoxyribonuclease催化DNA降解成更小组分的酶。3.10检验examination分析检测analyticaltest以确定一个特性的值或特征为目标的一组操作。注：从分离的分析物开始、包括各种用于定性或定量检验的参数测试或化学操作的过程。[来源：GB/T22576.1-2018，3.7，有修改,删除原注1~3，补充新注，“分析检测”被添加为首选术语。]3.11大体检查grossing,grossexamination为获得诊断信息，在准备后续显微镜检查过程中对病理标本所做的肉眼检查。3.12均质homogeneous结构和组成均匀3.13干扰物质interferingsubstances（。3.14检验前过程pre-examinationprocess分析前阶段preanalyticalphase分析前工作流程preanalyticalworkflow.10.18）的采集、运送到医学或病理实验室和在实验室内进行运送、分析物（3.3）的分离并以分析检验（3.10）开始为结束的过程。注：检验前阶段包括影响预期检验（3.10）结果的准备流程。[来源：GB/T22576.1-2018，3.15，有修改]3.15能力验证proficiencytest利用实验室间比对，按照预先制定的准则评价参加者的能力。[来源：GB/T27043-2012,3.7，有修改]3.16室温roomtemperature本文件中是指18℃-25℃。[SOURCE:ISO20184-1:2018,3.19]注：地方或国家法规可能存在不同定义。3.17样品sample取自原始样品（3.19）的一部分或多部分。[来源：GB/T22576.1-2018，3.24，有修改]3.18原始样品primarysample标本specimen为检验（3.10）、研究或分析一种或多种量或特性而取出的认为可代表全部的一独立部分的体液、呼出气、头发或组织。[来源：GB/T22576.1-2018，3.16，有修改]3.19稳定性stability在特定条件下贮存时，样品（3.17）材料在特定时间内保持规定特性值在特定范围内的能力。注：本文件涉及的分析物（3.3）是所分离的DNA（3.7）。[来源：GB/T15000.2-2019，2.1.15，有修改]3.20贮存storage在适宜的条件下长时间中断样品、分析物或其衍生物（如染色切片或组织块）的分析前工作流程，以保持其特性。注：通常在实验室档案库或生物样本库中进行长时间贮存。3.21确认validation通过提供客观证据对特定的预期用途或应用要求已得到满足的认定。注：“已确认”一词用于表明相应的状态。[来源：GB/T19000-2016，3.8.13，有修改，删除原注1和注3。]3.22验证verification通过提供客观证据对规定要求已得到满足的认定。注1：“已验证”一词用于表明相应的状态。注2：认定能包括以下活动进行替代计算；将新的设计规范与类似的经验证的设计规范进行比较；进行检测和演示；在发布前审查文件。[来源：GB/T19000-2016，3.8.12，有修改]3.23热缺血warmischemin失去正常血液供应的组织从身体内移除前的状态。[SOURCE:ISO20184-1:2018,3.25]3.24工作流程workflow完成任务所需的一系列活动。[SOURCE:ISO20184-1:2018,3.26]总则医学实验室质量管理体系的通用要求，特别是关于标本采集，接收和处理（包括避免交叉污染），参见GB/T22576.1-2018条款4.2,5.4.4,5.4.6或GB/T27020-2016条款8和7.2。有关实验室设备、试剂和消耗品的要求应遵循GB/T22576.1-2018条款5.3GB/T22576.1-2018条款或GB/T27020-2016条款6.2。（即整个工作流程（运到医学实验室和在医学实验室内与RNADNA10DNA在DNAISO14974关于标本运送和处理的安全说明应符合GB/T22576.1-2018条款5.2.3和GB19781在整个检验前过程中，应采取预防措施，避免不同标本/样品之间的交叉污染，例如，在可行的情况下使用一次性材料，或在处理不同标本/样品之间进行适当的清洁程序。（有关标本采集、运送、接收和处理的一般考虑，请参见ISO20658和ISO20387。实验室外部标本采集总则（参见条款。另参见GB/T22576.1-2018,5.4.4。患者/标本供者的信息记录应包括患者/标本供者ID，能用编码形式。该文件应由负责标本采集的部门记录，并宜包括但不局限于：患者/标本供者的相关健康状况，例如：健康与否、疾病类型、伴随疾病、人口学信息（如年龄、性别等）；组织采集前的常规医学治疗和特殊治疗相关信息，例如麻醉剂、药物、外科手术或诊断程序；患者/标本供者的相应的知情同意。标本相关信息文件记录应包括但不局限于：相关的血管结扎/夹闭时间点（通常为动脉夹闭时间）来表示体内缺血开始（热缺血）；注：不需要进行小组织切片活检切除冷冻。组织离体的时间、日期及离体方式（例如：核芯针穿刺、切除及其他活检装置采样）；（如果在实验室外进行组织冷冻，则应记录6.2中描述的步骤，需要进行病理评估时，应执行6.3。文件记录还宜包括标本采集人员身份信息ID，能采用编码的形式。标本处理（例如通过内窥镜检查获取的活检标本，或者在需要快速冷冻切片诊断的外科手术过程中从患者身上取出的标本）。应记录对离体标本所进行的任何添加或变动，例如油墨标记、缝线、切口等标本的方位标记。如果标本需要进行病理诊断，则应由具有医师资格的病理学家采样，或者在其监督、指导下进行（参见6.2），这些人员宜了解对标本的所有检验，以保证正确处理。如果在没有病理诊断要求的情况下取出标本，评估标本的选择和记录可由病理学家以外的其他有资质的人员进行。DNAISO20166-3DNARNA都要进行检验，请参见1S020184-1。DNA（例如甲基化/样品宜立即冷冻（6.3)。冷冻能在病理学家的指导或监督下，在实验室外或在实验室内进行。如果标本或样品在实验室外冷冻，立即进行6.2。如果标本或样品在实验室内冷冻，则需要将新鲜的组织标本运送到实验室。应立即执行5.2中描述的新鲜组织运送的步骤。新鲜组织运送要求总则运送准备应执行以下步骤：选择和使用容器和包装（例如冷却箱、贮存和运输箱、真空包装）；注1：根据适用的运送规定。选择和使用稳定程序（例如冷却方法）进行运送；注2：意外冷冻新鲜组织（例如以错误的方式使用冷包）可能导致组织解冻时DNA降解，还可能影响形态特征。容器的标记（例如注册号、条形码、标本类型、数量和等级、来源的器官组织）和其他文件[5.1.2,5.1.3,5.1.4和5.2.2a）和b）]。单个容器可只容纳几个标本，如果这些标本取自同一部位（即相似或相应的解剖后者组织器官部位），并具有相同的大体特征，例如组织类型和疾病状态(如炎症、肿瘤和坏死)。注3：具有相同大体特征的标本可能具有不同的分子特征。2℃至DNA（例如碎裂）。或者，根据预期的检验要求，在室温下短时间暴露(例如≤3小时)也能接受。在检验的开发过程中，应规定并验证在规定温度范国内的最长储存时间。（8℃估算。运送中（例如温度跟踪如果标本尚未冷冻，宜立即置于冰上或维持温度在2℃~8℃情况下进行即时运送，以尽量减少DNA谱的变化。应记录与既定运送程序规程的符合性，并且应描述和记录存在的任何偏离。实验室内部标本接收相关信息应记录标本接收人员的姓名（能以编码形式）、所接收标本的到达日期、时间及状态（例如标签、包括温度在内的运输条件、组织类型和标本数量、容器泄漏/破损）。与既定运输程序的任何偏离都应记录（参见5.2）。（参见5.1.1和、住院号和/或捐赠者/患者ID、患者姓名、出生日期和组织类型。对于不符合说明书的情况均应记录，例如标签、贮存和运送条件（温度和持续时间）、标本和泄露/破损的采集容器。标本病理学评估和样品选择标本病理学的评估和记录以及从标本中选择用于进一步处理的样品应由具有医师资质的病理医师完成，或在其监督或负责下完成。当地、国家或地区法规能适用。选择用于DNA检验的样品。用于分子和组织病理学检查以及可选的进一步研究目的标本的适当部分的选择应由具有医师DNA位。宜对组织进行显微或手工切割以选择或富集疾病的某些细胞特征。注1：根据当地程序，标本的适当部分的选择也能在实验室外进行，例如，在手术室（参见5.1.4）。在对手术标本进行大体检查时，应在冷冻前和/或冷冻后检查标本的正确身份。宜核对标本的临床信息（.3）（住院号和/或病理学号和/或供者/患者ID，患者姓名，患者出生日期和组织类型。手术标本和所有发现应根据各医学会的指南适当描述，并与临床信息和问题相关联。应描述标本的解剖学定位，必要时可标记切除边缘和其他重要区域，有助于以后的显微镜评估；可拍摄照片。应根据各医学学会的器官/疾病相关指南，获取有代表性的用于显微镜评估的样品（即大体检查）。注2：上述评估或记录也能在实验室外进行，例如：在手术室。当标本从体内取出而不需要进行组织病理学诊断时，该标本的记录以及样品的评估、选择和记录可由其他合格人员进行，而不是病理学家。（标本或样品的冷冻1）,2）或3）】。小瓶在预先冷却之前应贴上标签。na-frezngroedre)]CH2-甲基丁烷80℃至＞-160℃，能用于急速冷冻。能使用液氮（-196℃），干冰（-80℃），-80℃冷冻箱或专用冷冻设备进行预80（例如玻璃烧杯10倍。对于快速冷冻，组织样品应完全浸没在预冷却的异戊烷中。快速冷冻程序(fast-freezing80℃至＞-196夹具将金属板或金属篮固定到位。或者，样品能直接在液氮中冷冻，或者在液氮或干冰中的标记和封闭的贮存瓶中冷冻。然而，缓慢的冷冻过程能导致膜破裂，因为盐的浓度升高和晶体形成能严重影响形态。为避免交叉污染，宜在冷冻样品之间清洗篮子或盘子。注：在液氮中冷冻的特点是由于其相对较高的温度，液氮在组织周围沸腾引起的莱顿弗罗斯特效应[11]。这减少了从样品到液氮的热传导；当将样品在冷冻前放入标记的小瓶中时，这种情况会变得更糟。快速冷冻切片诊断的组织冷冻程序【另见6.2c)】：组织宜新鲜运送到实验室，不得延误。标本的选定部分应放在合适的冷冻介质中，冷冻在适合低温恒温仪器的专用支撑装置（例如金属网格、底座、圆盘）上。应记录使用的冷冻介质。含有组织和冷冻介质的支撑装置宜冷冻用冷冻培养基处理的样品宜贮存在-70℃以避免干燥，在使用每种冷冻介质处理样品前宜先评估DNA的质量（参见6.6）。在冷冻程序之前、期间和之后应执行以下步骤：冷冻程序的记录（例如在液氮中冷冻，在液氮或干冰冷却的异戊烷中快速冷冻，在适当的冷冻介质中冷冻，以受控制的冷却速率冷冻）；（以确定滞后时间：从身体移除之间的时间段-直到标本或样品冷冻）；于低温贮存的冷冻容器：冷冻容器应具有足够的体积以适应保存的标本或样品的大小；冷冻容器应经过贮存温度认证；冷冻容器应安全密封，最好用螺帽固定;不得使用带翻盖的容器；注：由于密封不正确，当容器存放在液氮中时，管内液氮发生泄漏时，容器能在标本或样品回收时爆炸。确定样品所需的组织尺寸是否适合冷冻前选定的低温小瓶，因为组织大小决定了容器的大小;因此，建议标本/样品在一个维度上不超过1标签应适合各自的冷冻贮存条件；注：合适的标签[例如自粘标签、手写、射频识别（RFID）、预先标记的容器]应通过质量验证。容器的标签应确保标本和样品的适当可追溯性。因此，容器标签应提供以下最基本信息：标本供者//ID/组织类型，组织和疾病状况影响（例如肿瘤）或未受影响，除非样品跟踪系统能将这些6.3f）1）中使用的标本或样品的识别信息相匹配；每个容器的唯一编号，能括在6.3f）1）中。标本或样品的类型，数量和描述的文件（例如肿瘤（贮存要求恒温应≤-70℃。宜用监测温度的系统。冷冻机或液氮罐应具有温度报警系统。在取回标本或样品期间可能发生严重的温度变化。因此，检索时间宜尽可能短，以避免样品解冻。应记录能使待处理或进一步贮存的标本或样品解冻的偶然发生的温度变化。宜供备用低温贮存设施。应记录从贮存系统中取出任何标本或样品的贮存位置、贮存温度、时间和日期。DNA总则（（例如在苏木精/切片上DNA所有能接触样品或组织载玻片的材料，包括裂解缓冲液和含有该缓冲液的小瓶，用于操作冷冻样品进行冷冻切片或转移至裂解缓冲液的小瓶和工具应清洁且无核酸酶。在使用前，所有材料（不包括裂解缓冲液和含有此缓冲液的小瓶）和用于操作冷冻样品进行冷冻切片并转移至裂解缓冲液的工具应冷却至＜0/形态学变化（例如肿瘤含量）DNA（H&E）染色来检查形态学。应记录所使用的方法以及过程中使用的试剂盒和批号；提取的DNA宜保存在冰上或2℃至8℃（例如冷冻头），并宜立即检测或长期贮存；为避免DNA检验中扩增材料的交叉污染，DNA的分离不宜与检验过程的扩增步骤在同一区域进行，除非使用封闭系统，以避免交叉-污染。如果对标本或样品的正确识别存在疑问，则应验证标本/样品的身份，例如在人类身份检测中使用的方法，如短串联重复（STR）分析。DNA的分离是诊断工作流程中的关键步骤，在整个工作流程的验证过程中应特别关注。宜在DNA能力检测程序中检测DNA分离性能。使用商品化试剂盒当使用专用于从冷冻组织中分离DNA的商品试剂盒时，应遵循制造商的使用说明。使用实验室自建程序如果实验室使用不同于商品试剂盒的自建程序，则应确认证明它符合目的，应编写说明并遵守。使用不同制造商的产品能影响结果，因为产品不必兼容。只有在组件经过配套测试并通过预期检验验证时，它们才宜应用于诊断测试。实验室开发的冷冻组织切片DNA分离程序宜包含以下步骤：组织切片在裂解缓冲液中重悬。用蛋白酶K消化去除蛋白质，并从较大的切片或片段中释放DNA。对于蛋白酶K消化步骤（例如在55℃至56℃进行），宜优化裂解缓冲液，然后进行蛋白酶K热灭活步骤，例如在95℃进行。注:有些商业试剂盒和实验室开发的蛋白酶K方案可用于从同一组织中依次分离RNA和DNA案往往会导致一些DNA损失并将DNA带入到RNA提取过程中，并可能影响从一定量组织中提取的预期DNA产量。可选方案：如需要无RNA的基因组DNA，则与RNaseA一起孵育。注1：当使用实验室开发的方法时，过量的RNA可能会与DNA共纯化，从而可能干扰预期的检验。在这种情况下，可能需要加入RNase消化步骤。注2：即使在消化后，如果消化的RNA片段在DNA纯化过程中未被