钾离子通道的结构与功能研究进展

钾离子通道的结构与功能研究进展

离子通道是细胞特定的两亲性膜整合蛋白质。它通过残基侧链的选择性和离子相互作用，起到了特殊的渗透性障碍功能。离子通道与多种生命活动密切相关,同时也是药物设计的重要靶标之一。自从采用了细胞膜片钳和单通道记录技术,人工膜离子通道重建技术、基因重组技术、通道蛋白分离、纯化等生化技术使许多通道蛋白的分子结构已经逐步清楚,其cDNA已经被克隆。目前认为,K+通道是离子通道中种类最多,存在最广泛且最复杂的一大类离子通道。研究成果表明,K+通道有两大家族,他们的结构和功能各异。1通道蛋白的结构纵观K+通道的研究发展史,有不同的分类方法,其分类依据大致为:电导、电压与电流特征,生物种系,通道分子结构,氨基酸序列,通道蛋白的同源性等。在哺乳动物中K+通道共分为两大家族:电压门控通道家族和内向整流通道家族,它们的结构特征和功能有着显著的差异。1.1k+ca2+k+通道电压门控K+通道(除钙激活K+通道KCa以外),为六跨膜结构单孔道(sixtransmembraneone-pore),经6次(S1-S2)穿膜,在S5与S6之间夹一个相当于钠通道P段的H5段。每个通道拥有4个如此重复的成分。此种基本结构与Na+、Ca2+通道相同。通道的活化闸门也是由4个S4构成(见图1)。所不同的是钾离子通道每个亚单位含有1或2个功能区(1or2poredomains;单p区或双p区),而Na+、Ca2+通道则具有4个。电压门控K+通道又称电压依赖K+通道(Kv),是已知种类最多的离子通道家族。又可以分为三类:(1)延迟整流K+通道(delayedrectifier)(Kr):Hodgkin等在乌贼巨轴突发现的K+通道属于此类。膜去极化时经过延迟才激活,失活也缓慢。时间从数百毫秒至数十秒不等。(2)A型瞬时K+通道(KA)和毒蕈间敏感的M通道:A型瞬时K+通道(KA)最初由Conner和Stevens在海兔神经元记录到而命名。它的激活和失活都迅速,由于活化后约1ms灭活闸门就启动,故又称为快瞬时K+通道(fasttransientKchannel)。(3)钙激活K+通道(KCa),它受到电压和钙离子的双重门控。其结构略有不同(见图2),有两个功能独特的区域,为二跨膜结构单孔道。由去极化激活,但还受到胞内钙离子浓度的调控。KCa又分为三类:largeconductance(BKCa)、smallconductance(SKCa)和intermediateconductancechannels(IKCa)。每一类中又可分成不同的亚类,在人类淋巴细胞中主要是IKCa1,在Jurkatcell中主要是SKCa2,SKCa3主要存在于B淋巴细胞和小鼠胸腺细胞中。1.2kv和roret组成多跨膜结构单孔道,为四跨膜结构单孔道,kir.我国各级别内向整流K+通道(Kir)的分子结构直到1993年才被阐明,它由两次穿膜螺旋和夹于其间的H段构成,为四跨膜结构单孔道(sixtransmembraneone-pore),即只相当于Kv分子的后半部,它没有闸门和电压感受器(H5)结构。细胞膜KATP的分子结构及电生理学特点属Kir。近数年来在线粒体膜上发现一类新型KATP通道(mitoKATP),其分类能否归属于Kir,目前尚未定论。2k+通道seK+通道的基本分子结构包括氨基末端胞质域的T1四聚功能域,六个跨膜α-螺旋域(S1-S6)、电压感应域(S1-S4)、在S5-S6之间的孔区域(1个P环)和一个细胞质内羧基胞质域。K+通道由孔道形成亚基(α-亚基超家族)和辅助亚基β组成。辅助亚基β可调节α-亚基的表达、分布、通道开放-关闭的动力学及药理学特性等。2.1k+通道结构KcsA(链霉菌属的K+通道)每个亚单元由两个横跨细胞膜的α螺旋组成,两个α螺旋之间由一个孔区域连接,孔区域由角塔(在外螺旋(M1)和短螺旋(P)之间)、孔螺旋和选择性滤器组成,大约含有30个氨基酸。两个α螺旋的内螺旋面向离子通道中心,短螺旋(P)和内螺旋(M2)构成通道内壁,而外螺旋面向脂膜。4个亚单元的内螺旋在膜内的互相靠近,形成倒圆锥形。内螺旋相对于细胞膜以25°角倾斜并略带弯曲,使得亚单元像“花瓣”一样朝向胞外并靠近细胞膜的外表面,完整的KcsA是由M1-P-M2亚基构成的同源四聚体。在“花瓣”部位上的亚单位含有K+通道的信号序列,形成离子选择性滤过区。K+通道孔道形成亚基主要由4个糖蛋白(亚单位)构成,与shake相关的哺乳动物K+通道亚单位,它们分别是Kv1(Shaker)、Kv2(Shab)、Kv3(Shaw)和Kv4(Shal)。但通道亚单位四者只居其一,其中每个亚单位蛋白迂回跨膜6次,分别命名为S1～S6区,每个通道拥有4个如此重复成分。四个重复成分的功能区连结沟通,S5和S6之问的短肤参与构成孔道,成为离子通路的干道,此结构称为“H5”区或通路区(见图1)。N端和C端均位于细胞内,S4含有带正电荷的氨基酸残基,为电压感受器,S4-S5链接区与钾通道的电导大小和失活相关,人类K+通道S6螺旋含有一个保守的P-V-P基序,该基序起到铰链作用,类似于KcsA中的T-V-G-Y-G基序。K+通道分子的N端与K+通道的快速“失活”有关,N断形成一个球型失活粒子,阻断通道内口,这种快速失活称为N型失活。在N端失活粒子与膜相连的“链”插入50个氨基酸残基段,可延缓K+通道失活过程。推测这是因为“链”加长后,失活粒子找不到进入K+通道内口所致。N端失活粒子突变后,K+通道不再失活。去除N端的shaker型K+通道失活缓慢的机理就非常明确,它依赖于S6细胞外端的氨基酸,称为缓慢型或C型失活。N端还有一个T1结构域,C端也发现了一些功能序列。胞外区有三个N-连接糖基化位点、胞浆区含两个cATP磷酸化位点。哺乳类动物K+通道H5区(通路区)主要有三种结构(见图2)。其一为电压-门控型。特点为亚单位跨膜的S5与S6段间为两者的功能区,系单P区。其二为内向整流型K+通道(Kir),其结构类似于电压门控与Ca++激活型,不同之处在于单P功能区位于S1与S2间。第三类结构特点为亚单位的6个跨段具有2个功能区,分别位于S1与S2、S3与S4间,因而谓之双P区型K+通道。两功能区内经S2与S3呈串连相通,故又称为串连P区型K+通道。2.2kv1.2离子通道目前对K+通道孔道可溶性辅助亚基β的结构和功能还不是很多,一般认为与该亚基可能参与K+通道的开启和失活。MacKinnon等最近发表了关于Shake家族的哺乳动物Kv的结构。Kv离子通道根据膜电压来调控K+的穿膜过程。这些最新文章则研究了大鼠脑中Kv1.2离子通道及其β2亚基的晶体结构(β亚基可以在体内调控哺乳动物Kv离子通道的活性),分辨率可达2.9-Å。这个四倍性复合物具体的结构如下(见图3):穿膜区域,包括通道的孔和四个电压感应器(voltagesensor);一个膜内(T1)结构域,由四个Kv1.2亚基的N末端构成;四个β2亚基,结合到T1结构域上。这个离子通道有些类似于原核生物K+通道,但有一个重要区别就是:Kv1.2离子通道内螺旋的曲率(curvature)是由保守的Pro-X-Pro序列引起的,而原核生物钾离子通道的曲率则是由一个Gly残基引起的。最近有研究首次观测到了KCHIP辅助亚基在分子和原子水平调节Kv4钾通道功能的结构基础,到了Kv4.3N-terminus与KChIP1的复合晶体结构(分辨率为3.2-Å),并从中发现这一复合物独特的一种钳状活性位点(clampingaction),在这个位点中一个单KChIP1分子可以夹紧相邻的两个Kv4N-末端,形成一个八核苷酸序列(octamer)。而且Kv4.3N端最外侧多肽被KChIP1表面的一延伸沟绑定,而这一沟槽是KChIP1调控Kv4.3不可或缺的结构,同时KChIP1分子也结合在临近的T1位点,稳定Kv4.3四聚体通道。3sh结论与k+通道的关系编码K+通道的第一个基因是完全通过分子遗传技术确定的。果蝇突变体暴露于酯类麻醉剂,腿、翅膀及腹部出现不自主的颤抖,这一突变体为shaker突变体。突变体神经细胞不出现复极化,因而动作电位时间IK(A)shaker基因编码了KA通道。shaker基因的定位很困难,最后是在应用了一种“染色体步移”(chromosomewalking)和作图技术,才在突变体中发现shaker基因,1987年shaker基因DNA序列被测出。实际上shaker基因是个含有几个内含子(instron)的巨大基因,编码12个密切相关的K+通道,其初级转录是剪切后mRNA片段,选择与不同的外显子(exon)组合形成成熟的mRNA。随后,用与shaker基因互补的寡聚核苷酸探针寻找相关基因,结果在果蝇又发现了另外三个基因,shal、shaw和shab。在哺乳动物亦发现了这四个基因,与果蝇的序列同源性在55%～82%之间。脊椎动物shaker基因是12个无内含子的基因家族。所以,虽然果蝇shaker通道的多样性是由剪切后mRNA片段产生,但脊椎动物shaker通道是由各自的基因编码而成。这表明K+通道多样性在早期进化时存在两种途径。DNA序列分析显示,果蝇及脊椎动物shaker、shal、shaw及shab基因编码的K+通道的一个独立的结构域。每一基因编码产物含有6个跨膜(TM)疏水段,部分为A螺旋,N末端、C末端位于胞浆面。第5号基因slo,编码BKCa通道,序列分析表明BKCa除K+通道常见的结构域外,有个很长的C末端,也可能含有更多的TM节段。内向整流K+通道Kir(已发现有12个相应基因:KCNJ1～KCNJ11和KCNK)为超极化电流所激活,去极化时灭活。4对k+通道的研究是进一步提高认识水平和完善的一个重要研究概念分子生物学和基因重组技术也为离子通道的研究提供有效的途径,X衍射晶体学为K+通道的结构研究提供了直