超临界流体萃取法提取螺旋藻糖脂的研究

超临界流体萃取法提取螺旋藻糖脂的研究

低等植物，包括优质蛋白质、丰富的维生素和矿物质。特别是其所含的糖脂:MGDG(单半乳糖二乙酰甘油脂),DGDG(二半乳糖二乙酰甘油脂),SQDG(硫代异鼠李糖二乙酰甘油脂),虽然含量很少,却能有效防治心血管疾病,改善脂质代谢,降低血压。因此,螺旋藻中糖脂成分的提取及其定性、定量分析,对于合理、有效的利用螺旋藻资源是非常重要的。我们采用苯酚—硫酸比色法及EDTA滴定法,分别对超临界萃取与有机溶剂萃取两种来源的螺旋藻糖脂成分及含量进行了测定,并对不同方法的优劣进行了初步探讨。1其他醇、苯酚、硫酸、edta主要材料及试剂:螺旋藻粉末、氯仿、乙醇、苯酚、硫酸、EDTA等。主要设备:旋转蒸发器、医用真空泵、800型离心机、721分光光度计、马福炉、烘箱等。2方法和结果2.1中螺钉中的糖脂2.1.1原料提取法的粗提糖脂本研究所用的超临界流体萃取的螺旋藻糖脂提取液,由青岛海洋大学张朝辉老师提供。提取液于70℃真空旋转蒸发去除乙醇,产物称重。2.1.2u3000电动器、乙醇、乙醇等为混合液、膜的制备取25g螺旋藻粉末,置于1000ml烧杯中,加入500ml乙醇,烧杯口处覆保鲜膜,用电动搅拌器于低速下搅拌12h,抽滤。滤液于70℃真空旋转蒸发去除乙醇,产物称重。2.2超临界萃取与有机溶剂萃取对螺干糖脂含量的影响将以上两种来源的螺旋藻糖脂粗提产物,分别加入50ml乙酸乙酯及100mlpH2缓冲液(pH2缓冲液制法:取3.7275gKCl,6.5ml2mol·L-1的盐酸,25gNaCl,加蒸馏水定容至1000ml),置于500ml分液漏斗中,混匀静置8h。取下层提取液,按提取液∶甲醇∶氯仿=1∶1∶2的比例,依次向分液漏斗中加入提取液、甲醇、氯仿,混匀静置8h,取下层溶液,即为精提糖脂的氯仿萃取液。将其真空旋转蒸发去除氯仿,即得到高浓度的螺旋藻糖脂(另含部分叶黄素及胡萝卜素等),以氯仿定容至10ml,留待糖脂成分分析时使用。超临界流体萃取与有机溶剂萃取两种方法得到的产物中,总脂(糖脂及少量叶黄素及胡萝卜素等)含量见表1。由表1中数据,我们发现超临界萃取法得到的螺旋藻提取物中总脂含量低于有机溶剂萃取法得到的螺旋藻提取物中总脂含量。另据观察发现,在精提糖脂的过程中,经超临界萃取的样品,其氯仿提取液呈微黄色,而有机溶剂萃取的样品,其氯仿提取液呈棕黄色,表明超临界萃取法得到的螺旋藻提取物中叶黄素及胡萝卜素含量较少(这一点在以后的实验中亦得到了验证)。2.3分析了螺旋糖脂成分的定性分析2.3.1层析板的准备按硅胶∶CMC(0.4%)=1g∶3ml的比例溶解硅胶,铺板,于50℃烘干水分,再于120℃活化30min。2.3.2糖脂精提液层析板的选择将标准样(SQDG,DGDG,MGDG的混合糖脂)、超临界与有机溶剂萃取法得到的糖脂精提液分别点样于层析板上,以氯仿∶甲醇∶冰乙酸∶水=100∶20∶12∶5的展开液展开,乙酸铜喷雾显色,于120℃烘干8min。对比标准样,可以确定两种方法得到的糖脂精提样中均含有SQDG,DGDG,MGDG,结果见图1。2.43螺旋糖脂成分的测定2.4.1sqdg含量的测定样品中的SQDG中含有定组分的硫,将样品灰化后使其转变为硫酸根,在微酸介质中,硫酸根被过量的BaCl2定量的沉淀,剩余的BaCl2可以用EDTA溶液滴定。通过计算硫酸根所消耗的BaCl2的量,进一步可以计算出SQDG的含量。取一定量的糖脂精提液(约含总脂40mg),加入0.2ml0.1mol·L-1的MgNO3,先电炉消化,后在马福炉于550℃灰化5h。灰化样用蒸馏水润洗、过滤。滤液分为平行的两份,分别用蒸馏水稀释至50ml,加入浓盐酸1滴使呈微酸性,一边摇动一边加入0.025mol·L-1的BaCl2溶液5ml,使形成BaSO4沉淀。稍置后加入NH4Cl-NH4OH缓冲液2ml,0.5%铬黑T和0.2%甲基红各10滴,以0.01mol·L-1的EDTA滴定至溶液由酒红色经灰色至鲜绿色。两次滴定消耗的EDTA毫升数取平均值,记为a值。另取蒸馏水为空白,加0.2ml0.1mol·L-1的MgNO3,NH4Cl-NH4OH缓冲液2ml,0.5%铬黑T4滴,0.2%甲基红3滴,滴定所消耗的EDTA毫升数记为c值。由SQDG(mg)=(c-a)×0.02×568得到样品中SQDG的含量,结果见表2。根据表2的结果,我们发现超临界流体萃取法得到的产物中SQDG的含量较高。另外,在实验中我们发现,指示剂的用量及比例对该测定方法中终点的指示灵敏度有影响,经过验证,上述方法中的指示剂的用量及比例较为合适。2.4.2超临界流体萃取法以微量进样器将超临界与有机溶剂萃取法得到的糖脂精提液各取0.01ml于薄层层析板上点样,以氯仿∶甲醇∶冰乙酸∶水=100∶20∶12∶5的展开液展开后以碘蒸汽显色,待碘挥发后,用刮样器将层析板上包含所显色块的硅胶全部刮入离心管中,加1mol·L-1H2SO42ml,5%苯酚1ml,沸水浴20min后离心,取2.5ml上清液,沿壁加4ml浓H2SO4,显色30min后,于485nm处比色,以与刮入离心管中所显色块等量的硅胶作空白。根据测得的吸光值查标准曲线,可得SQDG的含量。同样方法,可以测得DGDG,MGDG的含量,只是以2%苯酚取代上述步骤中5%苯酚,且与480nm处比色。测定结果见表3。从表3可以看出,超临界流体萃取法得到的产物SQDG,DGDG,MGDG的含量均大于有机溶剂萃取法得到的产物。另外,本测定方法中不能使用乙酸铜喷雾显色,因为乙酸铜会吸附在硅胶上影响测定。使用碘蒸汽显色,碘挥发后则对测定无影响。3edta滴定法与苯酚—结论与讨论综合EDTA滴定法与苯酚—硫酸比色法测定的结果,可以发现用超临界流体萃取法提取的螺旋藻糖脂纯度高于用有机溶剂萃取法提取的糖脂,因此,将超临界流体萃取技术应用于螺旋藻中糖脂的提取,是一种高效可行的方法。对比EDTA滴定法与苯酚—硫酸比色法这两种测定方法,我们可以发现EDTA滴定法操作相对比较简便,稳定性较好,但其只能测定