5.3 基因克隆技术课件

5.3基因克隆技术基因克隆（分子克隆molecularcloning）----通过体外重组技术,将一段目的DNA经切割、连接插入适当载体,并导入受体细胞，进行永久保存和复制的过程。

以质粒为载体的

DNA

克隆过程目录具体流程（一）目的基因的获取（二）克隆载体的选择和构建（三）外源基因与载体的连接（四）重组DNA导入受体菌（五）重组体的筛选（一）目的基因的获取1.化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。2.基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)3.cDNA文库(cDNAlibrary)4.分离克隆差别表达的基因

*化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列（一）目的基因的获取1.化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。2.基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)3.cDNA文库(cDNAlibrary)4.分离克隆差别表达的基因

组织或细胞染色体DNADNA片断克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合*从基因组DNA文库获取目的基因目录限制酶切位点限制酶消化除去中间片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色体DNA限制酶部分消化外源DNA与载体DNA混合连接反应体外包装用重组噬菌体感染大肠杆菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文库目录（一）目的基因的获取1.化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。2.基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)3.cDNA文库(cDNAlibrary)4.分离克隆差别表达的基因

cDNA文库的构建

真核生物基因组DNA十分庞大，而且含有大量的重复序列。这是从染色体DNA为出发材料直接克隆目的基因的一个主要困难。

cDNA文库比基因组DNA文库小得多，能够比较容易从中筛选到目的基因。定义：（cDNALibrary）

某种生物基因组转录的全部mRNA经反转录产生的cDNA片段分别与克隆载体重组，储存于某种受体菌中，该群体就称该生物基因组的cDNA文库。原理：

将带poly(A)的mRNA经酶促反应转变为双链DNA，再与原核载体连接。mRNAcDNA双链cDNA

重组DNA分子cDNA文库

反转录酶

载体

受体菌

复制*从cDNA文库获取目的基因逆转录酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ碱水解

TTTT目录打开双链cDNA合成中产生的发夹环

一、制备用于克隆cDNA的mRNAmRNA的制备动物细胞mRNA的制备植物细胞mRNA的制备关键问题：制备mRNA(参考书p172)二、cDNA第一链的合成１、oligo(dT)引导的DNA合成法：

利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性，加入12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段，由反转录酶合成cDNA的第一链。２、随机引物引导的cDNA合成法见书图P174

根据许多可能的序列，合成出6-10个核苷酸长的寡核苷酸短片段（混合物），作为合成第一链cDNA的引物。在应用这种混合引物的情况下，cDNA的合成可以从mRNA模板的许多位点同时发生，而不仅仅从3’-末端的oligo(dT)引物一处开始。三、cDNA第二链的合成1、自身引导合成法：

单链cDNA的3’端能够形成发夹状的结构作为引物，在大肠杆菌聚合酶IKlenow或反转录酶的作用下，合成cDNA的第二链。三、cDNA第二链的合成1、自身引导合成法：单链cDNA的3’端能够形成发夹状的结构作为引物，在大肠杆菌聚合酶IKlenow或反转录酶的作用下，合成cDNA的第二链。缺点：

在以S1核酸酶切割cDNA的发夹状结构时，会导致对应于mRNA5’端的地方的序列出现缺失和重排。S1核酸酶的纯度不够时，会偶尔破坏合成的双链cDNA分子。2、置换合成法原理：以RNA酶H在第一链合成产物cDNA：mRNA杂交体的mRNA链上造成切口和缺口，产生一系列RNA引物，在大肠杆菌DNA聚合酶I的作用下合成cDNA的第二链。优点：a）合成cDNA的效率高

b）直接利用第一链的反应产物，不需纯化

c）避免使用S1核酸酶来切割双链cDNA四、双链cDNA分子与载体进行连接

将合成的双链重组到质粒载体或噬菌体载体上，转化大肠杆菌寄主细胞增殖。cDNA文库的构建由于种种原因（例如RNA制备过程中，由于RNA不稳定，获得5′端或3′端序列缺失的非全长mRNA。以此为模版合成非全长cDNA。）cDNA常用cDNA文库的构建技术获得的cDNA并不是全长cDNA，通常5′端或3′端序列缺失。常用RACE技术克隆缺失的5′端或3′端缺失序列。RACE技术（rapidamplificationofcDNAends）是一项在已知cDNA序列的基础上克隆5′端或3′端缺失序列的技术。获得高质量总RNA去磷酸化去掉mRNA5′帽子结构加特异性RNA寡聚接头合成第一条cDNA链5′RACE3′RACE将纯化后的PCR产物克隆到载体DNA中，进行序列分析RACE主要操作方法RACE技术的作用1.获取全长cDNA序列。2.有助于研究5′端和3′端非编码序列。研究转录起始位点，启动子等。基因文库的筛选课本p176.３.RT-PCR

RT-PCR是以mRNA为模板，经逆转录酶作用合成cDNA，再经PCR扩增，大大提高mRNA的检出灵敏度。主要应用于基因表达与调控的研究。可用于克隆已知部分序列的基因（片段）的克隆。综合性实验。RT-PCRRT-PCRcDNA（一）目的基因的获取1.化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。2.基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)3.cDNA文库(cDNAlibrary)4.分离克隆差别表达的基因

4分离克隆差别表达的基因基因的差别表达

根据表达特性的差异可将高等真核生物的基因分为两大类：一类叫做看家基因（house-keepinggene），以其组成型表达模式维持细胞的基本代谢活动；另一类叫做发育调控基因（developmentalregulatedgene），以其时空特异性表达模式完成个体的正常生长、发育与分化，我们将不同基因在生物个体发育的不同阶段，或是在不同的组织或细胞中发生的按时间、空间进行有序表达的方式称为基因的差别表达（differentialexpression）。应用mRNA差别显示技术

分离克隆目的基因1992年，美国波士顿Dena-Farber癌症研究所的两位科学家P.Liang和A.D.Pardee发明了一种叫做mRNA差别显示PCR（mRNAdifferentialdisplay）技术，简称DDRT-PCR，可以从一对不同类型的细胞群体有效地分离并鉴定差别表达的基因。应用cDNA差示分析法克隆基因cDNA差示分析法-RDA法(RepresentationalDifferenceAnalysis)充分发挥了PCR以指数形式扩增双链DNA模板的特性，通过降低cDNA群体复杂性和更换cDNA两端接头等方法，特异扩增了目的基因片段。试验对象（Tester）供试探针（Driver）4碱基切割酶处理平均长度256bp的代表群cDNAcDNA加12/24碱基接头补平末端以24碱基的互补序列为引物进行PCRT改换新接头D不加接头杂交：T:D=1:100设计新接头引物PCR指数扩增产物差异产物具体流程（一）目的基因的获取（二）克隆载体的选择和构建（三）外源基因与载体的连接（四）重组DNA导入受体菌（五）重组体的筛选（二）克隆载体的选择和构建

分子克隆载体是一类可供外源DNA插入并携带重组DNA分子进入适当宿主细胞的DNA分子。

将重点讲述分子克隆载体的特点;常见分子克隆载体;

分子克隆载体总述１、载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力为外源基因的扩增提供必要的条件２、载体特点至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制。2.

至少应有一个克隆位点，以供外源DNA插入。3.

至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞多克隆位点ori复制起始点遗传标记Amppolylinker基因载体载体类型１、质粒载体２、噬菌体载体３、cosmid克隆载体４、噬菌粒载体５、酵母人工染色体载体６、细菌人工染色体载体质粒(plasmid)

独立于细菌染色体外的双链环状DNA分子。

chromosomePlasmid1、质粒是细菌染色体外能自主复制的环形双链DNA分子。2、质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状态。３、质粒DNA在添加真核复制信号和启动子后，可以构建出能在原核和真核细胞中均可复制的穿梭质粒，并在真核细胞中表达，因此这类载体在基因工程中应用广泛。质粒的生物学特性４、根据每个寄主细胞中质粒拷贝数的多少，把质粒分为严紧型复制质粒（拷贝数少，为1-5个）与松弛型复制质粒（拷贝数多，可达10-200甚至更多个拷贝）。因此，作为载体的质粒应该是松弛型的。6、质粒的不相容：两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。T载体的T-A克隆原理：T-vector两条链的5’端含有一个游离的T，

PCR过程中，普通的Taq酶可在产物的3’端多加一个A穿梭质粒载体（shuttleplasmidvector）

是一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，因而可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体具体流程（一）目的基因的获取（二）克隆载体的选择和构建（三）外源基因与载体的连接（四）重组DNA导入受体菌（五）重组体的筛选（三）外源基因与载体的连接1.粘性末端连接方式：(1)同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接BamHⅠ切割反应

GGATCCCCTAGGT4

DNA连接酶15ºCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割载体DNA用BamHⅠ切割重组体载体自连目的基因自连同一限制酶切位点连接目录不同限制酶切位点的连接EcoRⅠ切割位点Bg

lⅡ切割位点+EcoRⅠ+Bg

lⅡ双酶切EcoRⅠ+Bg

lⅡ双酶切T4

DNA连接酶15ºC重组体配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。2.平端连接适用于：限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶15