植物瞬时表达系统的建立与应用

植物瞬时表达系统的建立与应用

0植物基因功能及基因外源基因表达系统的应用和完善随着大量序贯的完成，植物基因功能的研究进入了更深、更广泛的阶段。目前,对植物基因功能的研究主要通过转基因、基因敲除、基因沉默等方法。如:王力娜等克隆分析了与棉花开花有关的MADS-box基因家族,并利用转基因技术对其中2个基因进行了功能验证;李蓓等利用转基因技术获得了转TsVP的抗旱玉米,虽然分析F1代有抗旱性,但由于获得纯系玉米的实验周期比较长,不易在短期内验证基因功能;此外植物中的基因敲除、基因沉默主要通过随机插入突变引起基因失活,但有时会引起染色体重排,以致突变体表型与随机插入无关,而且对插入位点的确定、遗传学分析都比较困难。因此通过转基因和基因沉默技术验证基因功能,存在实验周期长,费时费力,且结果不一定理想等问题;此外,一些植物外源基因转化体系不易建立,也影响了利用转基因的方法检测、验证基因功能。因此在利用上述经典方式研究基因功能的同时,有必要建立一些快速验证基因表达、检测蛋白质互作、短期内能高效表达外源蛋白质的新方法。瞬时表达是指引入细胞的外源DNA和宿主细胞染色体DNA并不发生整合,而是随载体进入细胞后12h左右就可表达,基因产物在2~4天内即可被检测出。由于瞬时表达能表达多种外源基因,而且时间短,重复性好,弥补了常规转基因方式中周期长,转化效率低等一些缺点。因此,不同物种的瞬时表达体系也逐渐被建立。目前,植物瞬时表达系统已被陆续应用到生物学的许多研究中,尤其是利用该系统进行基因功能的鉴定分析、发现新型强启动子、蛋白质互作、亚细胞定位等方面;此外,该系统也可表达外源基因生产重组蛋白,为疫苗、抗体、生物制药的研发开辟了捷径。本研究就植物瞬时表达系统的起源,建立方法,应用等方面进行了概述,同时也针对该系统在应用中存在的不足提出了相应的建议。1植物基因突变基因瞬时表达系统起源于20世纪六七十年代,称为第一代瞬时表达系统。此时的瞬时表达技术主要应用于离体细胞、原核细胞中蛋白质的瞬时表达。Hoerz等利用蛋白质的瞬时表达分析了网织红细胞多核糖体中初始蛋白质的合成;Kryzek等研究了大肠杆菌argECBH基因簇在瞬时表达中的调控机制;随着生物学研究的不断深入,有关瞬时表达的应用也加快了步伐,如Klein等用基因枪成功地将外源DNA转入完整的洋葱表皮细胞,在2~4天内表达了外源基因;第二代瞬时表达系统的研究以原生质细胞为受体,如Fromm等采用电穿孔技术,将pNosCAT和pCaMCATV质粒转入玉米原生质体,得到瞬间表达。但第二代瞬时表达系统转化频率低,一般为10-6~10-2,且操作前需要准备大量的原生质体。第三代瞬时表达系统主要在植物活体中进行相关的研究,不同物种的瞬时表达体系也逐渐被建立。如柳枝稽瞬时表达系统、优化的烟草瞬时表达系统、草莓瞬时表达系统、莴苣瞬时表达系统、还有油菜籽、洋葱、黄瓜等植物的瞬时表达系统也被研发并应用。利用瞬时表达体系有助于研究本物种的相关基因及蛋白功能,Li利用拟南芥瞬时表达系统研究了d35s启动子活性、拟南芥中3个基因(At3g51660、At1g01170、At2g47840)的亚细胞定位及蛋白互作等相关问题;同时该系统也可表达外源基因生产重组蛋白,为疫苗、抗体、生物制药的研发开辟捷径,如Raffaele在烟草中瞬时表达了HIV-1的辅助蛋白Nef,为HIV疫苗的研发奠定了基础;Jussi在烟草瞬时表达体系中高效表达了来源于里氏木霉的疏水蛋白质基因。尤其在最近十几年内,随着瞬时表达与免疫组化、激光共聚焦扫描显微镜技术的结合,利用该系统进行相关基因、蛋白质方面的研究也越来越多,并开始向环境检测、病毒防治、微生物利用、细胞骨架等方面扩展,标志着瞬时表达体系在不断完善的同时也将进入更先进的一代。2基于植物的立即表达系统的设计方法植物中建立瞬时表达系统的方式有:PEG法、电激法、基因枪法、浸泡和摩擦接种法、病毒感染法和农杆菌介导法。2.1原生质体的制备困难该方法介导原生质体转化,是最早建立植物细胞瞬间表达的技术,但是转化率低、需要处理大量的原生质体且原生质体的培养较困难,也无法对组织、器官等特异性基因进行研究而逐渐被淘汰。2.2植物基因组织通过动力系统将带有基因的金属颗粒(DNA吸附在表面)以一定的速度射进植物细胞,由于颗粒小穿透力强,故不需去除细胞壁就可进入植物组织细胞。其优点:无宿主限制,靶受体类型广,具有潜在分生能力的组织细胞几乎都可以;操作简单、快速。缺点:转化率低;基因的整合位点不固定,易造成外源基因丢失,而不利于表达;此外,基因枪的费用较高。2.3泡沫和摩擦繁殖法将实验材料浸泡在外源基因的翻译产物RNA中或将其涂抹喷洒在材料表面。该方法对实验人员和实验环境的要求比较高,而且方式繁琐、不易操作。2.4外源基因检测以重组病毒作为载体感染植物细胞建立瞬间表达系统,其转化方式如下图1所示。其特点:不产生可遗传的后代,降低了基因漂移和病毒大规模感染的风险;载体稳定,表达水平高;操作简便。近年来利用病毒携带外源基因转入植物已有较成熟的技术,如豇豆花叶病毒CPMV、烟草花叶病毒TMV、普通花叶病毒PVX,TEV、TMV和PVY也是目前常用的病毒载体,此外个别TMV、PVX可以侵染单双子叶植物,扩大了寄主范围。但用此种方法,需将病毒本身的一些致病基因删除,以免导致植物感染病毒,引起植物病变或基因组发生变异,而不利于外源基因的表达。2.5常用载体和使用的菌株将携带外源基因的农杆菌利用真空渗透或直接注射到组织细胞中,利用质粒T-DNA区的转移进行转染,是研究植物转基因的常用方法之一,也是目前建立瞬时表达系统的优先选择。其流程如下图2所示。目前常用载体有pBIl2l、pMOG800等,常用农杆菌有LBA4404、EHAl05、Gv3101、AGLl等。农杆菌介导法操作简便,易于转染,但转染的宿主有限,常被用来转染双子叶植物,单子叶中的应用相对较少。而且一些外源基因可在农杆菌中表达造成假阳性,为避免该现象可构建携带内含子的质粒作为载体,如p2301质粒、Pcambia1301质粒等。由于内含子在真核生物mRNA成熟过程中可被精确地切除,而原核细胞不具有剪切内含子的功能,从而可避免由于农杆菌中遗漏表达造成的假阳性。3高通量基因和蛋白质的应用植物瞬时表达系统方便、简捷,可快速达到高通量筛选、鉴定基因和蛋白质的要求,可应用于研究启动子活性、基因功能、生产外源蛋白、亚细胞定位以及蛋白质组学等方面。3.1快速探索植物启动子的转录表达植物基因的启动子包含多种重要的顺式作用元件,这些元件和转录因子相互作用在转录水平上控制基因表达的起始时间和表达程度,进而调控下游相应基因的表达。将启动子序列与报告基因(Gus、GFP、Luciferase等)融合构建表达载体后转入植物细胞,通过报告基因的瞬时表达,短时间内即可确定启动子活性以及活性的强弱,如谢迎秋通过将棉花曲叶病毒(CLCuV)启动子在烟草和棉花中建立瞬时表达发现,该启动子是一种新型双向强启动子,可应用于双子叶植物尤其棉花的遗传转化中;Koia等通过该系统研究发现菠萝的转录因子SUI1和L36启动子能够驱动Gus在拟南芥中的表达;该系统也可快速确定同一启动子在不同植物中或同一植物中不同部位的作用,李昊通过Gus基因的瞬时表达,快速分析了毛白杨LEAFY同源基因PtLFY启动子在烟草不同部位的表达活性;Toshiki则利用瞬时表达系统研究了红藻紫属中启动子在配子体和孢子体不同的转录调控机制;唐杏娇等通过瞬时表达分析菊花叶片中CmDFR启动子片段发现,除了含有TATA-box、CAAT-box等基本的元件外,还含有与MYB转录因子相结合的元件。上述研究表明瞬时表达系统可应用于植物中启动子、增强子等转录元件的功能分析,发掘有用的强启动子,加快植物启动子的研究进程;同时了解启动子对转录调控机制的影响,以应用于基因工程中提高或改进外源基因的表达。3.2基因表达系统基因组测序的发展使大量基因的克隆和定位不断完成,但对它们的表达行为、产物性质及定位的认识并不清楚,基因与表型的对应关系以及基因的功能分析则成为迫在眉睫的问题。瞬时表达系统可在短时间内操纵组织细胞中相关基因的表达与沉默,加快基因的研究。竺晓平等利用马铃薯X病毒CP基因的瞬时表达在转化植物前快速地检测了转基因的表达情况以及表达产物的功能,节约时间和资源,也减少实验的盲目性;Pudota等通过马铃薯瞬时表达系统分析了大量晚期抗枯萎病基因RB,快速鉴定了各种RB基因的功能,加速了对马铃薯基因功能的研究。树木的生长周期一般较长,利用转基因技术对其基因结构功能的分析较少,但瞬时表达系统的建立为其研究开辟了一条捷径。雷蓉华通过APX基因(表达抗坏血酸过氧化物酶)在苹果叶片中建立了瞬时表达体系,优化了苹果的遗传转化体系;Zhang等通过桦树瞬时表达系统分析了肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)基因的过量表达和基因沉默,为下一步的研究奠定基础;近年来,瞬时表达系统在白杨树、楤木、柳树、桑树以及一些草本植物中也得到成功应用。瞬时表达系统还具有高通量筛选鉴定基因和蛋白的功能,快捷灵敏地检测、解析基因的剪接加工机制,如Craig等用此系统构建了含5个基因的融合载体,并对其功能进行了逐步的探索;高少培等利用烟草瞬时表达系统,对水稻BADH2和拟南芥GR7基因片段的转录后剪接加工机制进行了研究,并发现一些重要的剪接调控元件。3.3实时时域作用对植物抵抗tmv的影响RNA是生物体和生物细胞完成遗传和表达不可或缺的物质,利用瞬时表达系统与RNA干扰、RNA沉默技术相结合对RNA进行相关研究,高效识别不同种类RNA的功能特点,增加产物的多样性。如Cao等利用基因的瞬时表达鉴定了家蚕中调控蚕丝蛋白L链中41个保守的miRNA并确定了其中4个miRNA的功能特点;赵明敏也利用该技术研究了同源于TMV外壳蛋白的siRNA对TMV侵染的干扰机理,为植物抵抗TMV的感染提供理论基础;Pavan等利用双链RNA干扰烟草天蛾自身基因的表达,从而使CYP6B46,CYP4M1和CYP4M3基因在其体内得到瞬间表达,进而分析了CYPs类基因的功能。瞬时表达技术的运用还有助于了解vsiRNAs的组成、调控基因表达的潜力,以及病毒中RNA沉默抑制子(RSSs)的作用机制,为植物抵抗病毒的感染提供新策略。郝兴安等运用农杆菌介导的瞬时表达系统对黄瓜坏死病毒(CNV)p20蛋白的功能进行了系统分析,发现CNVp20在瞬时表达中不能有效抑制RNA沉默;景秀丽利用植物中建立的瞬时表达系统分析鉴定了6种禽类病毒对RNA沉默抑制的功能,并初步明确了HVT063和NS1的沉默抑制特点及作用机理。3.4重组蛋白及重组基因的活性作为一种安全、高效快速的外源蛋白生产体系——植物瞬时表达系统是近年来发展的一种新型蛋白表达方式。该系统不需要经历植物组织培养即可在短时间内、以低廉的成本获得多种外源蛋白,且外源蛋白产量高、易于纯化,为药用蛋白的表达,各种疫苗的研发提供一条捷径,也使植物成为快速高效表达外源基因的一个工厂。目前已有多种抗体、生长因子、激素、重组酶及多种疫苗分别在烟草、豆类、玉米、番茄、香蕉及莴苣等植物中成功表达。Noemi等将人乳头瘤病毒16L2型与马铃薯X病毒融合后,瞬时表达验证了植物是生产肽抗原的良好场所,为生产各种疫苗提供了实际经验;杨凤萍利用病毒载体在烟草中的瞬时表达,快速评估了外源基因HBsAg重组蛋白的免疫活性;刘月英等用马铃薯病毒X(pGR107)做载体在烟草中瞬时高效表达了人表皮生长因子(hEGF),表达量达总可溶性蛋白0.0103%,并具有良好的生物活性。表1为利用瞬时表达系统表达外源蛋白的部分实例。3.5进行亚细胞定位亚细胞中分布着参与细胞新陈代谢的多种蛋白质和酶,已有证据表明,亚细胞中的蛋白质亚组,经常共同作用行使一定的功能。因此了解亚细胞定位是全面理解细胞整体功能的重要环节。利用瞬时表达系统可在短时间内进行快速高效的亚细胞定位,如李超利用豌豆花瓣中建立的瞬时表达系统,分析了由于CYCLOIDEA(CYC)类TCP蛋白亚细胞定位的不同,导致TCP基因在豆科与玄参科植物中具有不同的功能;Zhang等运用该系统发现了水稻叶绿体中参与光合作用的一些酶;而朱丹等则利用烟草瞬时表达系统验证了可用于植物亚细胞定位的载体卡盒pCEG。3.6免疫荧光技术蛋白质是基因的产物,其功能是生物性状的直接体现。蛋白质、酶通常相互作用在信号转导和调控中扮演着重要的作用。植物细胞瞬时表达系统结合荧光蛋白融合技术或免疫荧光技术可用于蛋白质水平的研究,快速检测蛋白质在细胞中的分布,验证蛋白互用,揭示配体与受体的识别机理等。早在1987年Ballas等就利用质粒的瞬间表达检测了氯霉素乙酰转移酶(CAT)的活性;植物瞬时表达系统也逐渐应用于特异性蛋白的表达、互作机制等方面的研究,曹友志利用杨树瞬时表达体系从25个候选效应因子中筛选出4个重要的效应因子。这都充分表明植物瞬时表达系统可用于酶活性的测定、效应因子的筛选、蛋白调控等方面,加快蛋白质组学的研究步伐。4劳动时间和基因表达系统综上所述,植物瞬时表达系统为快速的表达外源蛋白提供了一个理想的工作平台,尤其对生产口服疫苗或药用蛋白。一方面缩短了实验周期、降低了实验成本;另一方面植物作为生物反应器安全、外源蛋白质产量高、易于纯化等目前已得到了广泛的应用。但瞬时表达系统也存在一些问题:(1)由于不产生可稳