化学蛋白质组学的研究进展

化学蛋白质组学的研究进展

一、化学和生物学的交叉现象,促使化学蛋白质组学成为可能化学是自然界的基础和中心学科之一。与此同时,化学也不断渗透到自然科学的前沿领域(特别是与人类自身健康密切联系的生命科学领域),成为自然科学中最富有拓展力和生命力的学科。19世纪以来,化学理论和技术介入到生物学并随之建立“生物化学”的新学科,使得生物学研究逐渐从宏观的描述水平深入到微观的分子水平,极大地促进了生物科学的发展。20世纪90年代以来,随着分子生物学技术的成熟和普及,对基因的生物学功能的了解愈显重要和迫切,基因的表达产物和体内功能的执行者——“蛋白质”的研究因而也日益成为生物学研究的关键。建立在遗传学基础上的基因敲除(knock-out)技术是目前揭示蛋白质在生物体内功能的最有效手段。但该手段也存在一些局限性:例如,基因敲除对构型的必需功能基因通常无能为力,应用于基因组复杂的高等动物难度很大;而且,由于体内相关基因的功能补偿机制,使得非必需基因的基因敲除结果有时较难解释。与此同时,基于靶蛋白质结构的合理药物设计的发展,迫切需要知道更多潜在的药靶蛋白的功能信息。在这两种因素的推动下,化学和生物学逐渐交叉形成了一门现在称为“化学生物学(chemicalbiology)”的新边缘学科。化学生物学,主要通过化学小分子对生物体功能靶蛋白的特异性调控,来研究活性小分子与体内靶蛋白的化学相互作用及其对生物体表型(phenotype)的影响,以利用化学小分子探测生物体功能,并在此基础上发现和优化具有重要生理病理调控作用的小分子药物。化学生物学诞生以来,在生物医学和新药创制中发挥了重要的作用。鉴于这个新学科的发展前景,美国哈佛大学化学系目前已更名为化学生物学系,我国北京大学也成立专门的化学生物学系以推动此领域的研究。21世纪人类基因组计划近乎完成的今天,生命科学进入了后基因组时代,化学生物学也随之拓展新的前沿。由于后基因组时代解码基因组蕴藏的全部功能信息的研究需要,加上90年代生物质谱技术和计算机技术的发展,催生了一门在蛋白质水平上对应于基因组学的新学科“蛋白质组学(proteomics)”,以研究特定条件下基因组表达的全部蛋白质。蛋白质组学的诞生对生命科学和相关领域产生了深远影响,现在每年的Science和Nature杂志均对此领域有专栏述评。正是在这样的背景下,2002年诺贝尔化学奖授予发明蛋白质软电离质谱技术的Tanaka等人,并将他们称为“蛋白质组学先驱”。与传统的蛋白质研究技术不同的是,蛋白质组学应用高通量的新技术手段,通过系统性、整体性和相互联系的新视角来研究基因组表达的蛋白质及其翻译后修饰,以便得到生物体生理病理和信号转导过程的功能整合信息。化学在这里再一次与生物学的最新发展融合,形成新的交叉研究领域——化学蛋白质组学(chemicalproteomics)。什么是化学蛋白质组学呢?化学蛋白质组学是一个目前仍在不断扩展中的全新领域,学术界至今对其尚未有确切定义。一定程度上,化学蛋白质组学可以理解为“化学加蛋白质组学”。具体地说,由于大多数蛋白质的功能直接依赖于小分子配体与靶蛋白的结合步骤,因此,利用能够与靶蛋白质特异作用的化学小分子来扰动和探测蛋白质组,有可能在蛋白质组的整体水平上,揭示感兴趣的特定蛋白质的功能以及它们与化学小分子的相互作用。有别于以往的主要以蛋白质定性定量鉴定为基础(identity-basedorabundance-based)的蛋白质组学技术,化学蛋白质组学利用化学小分子直接从功能角度切入蛋白质组的研究,因此,被认为是很有前途的新一代功能蛋白质组学技术(function-basedproteomics)。目前,美国著名的ScrippsResearchInstitute、哈佛大学InstituteofChemistryandCellBiology等研究机构正积极进行化学蛋白质组学的工作。以独立开展人类基因组测序而闻名世界的美国Celera公司也成立专门的DepartmentofChemicalProteomics从事化学蛋白质组的研究。近两三年来,化学蛋白质组学方面的研究论文纷纷在Science、NatureBiotechnology、PNAS、JACS等世界顶级科学期刊发表。二、蛋白质的修饰和活性化学蛋白质组学的研究内容目前集中于:在蛋白质组水平上,化学小分子与生物体靶蛋白的相互作用研究、基于靶蛋白功能的化学小分子探测蛋白质组、蛋白质的翻译后修饰研究(如蛋白质磷酸化)等。化学蛋白质组学可用于:解析生物体蛋白质的结构及其体内的生物学功能、研究药物作用机理、监测临床药物疗效、筛选新药以及环境毒理学等。1.小鼠肝脏蛋白质组的优势小分子与细胞内靶蛋白质的相互作用,是很多蛋白质生物功能的基础。这种相互作用强弱不一,既可以是可逆的,也可以是不可逆的;可以是单靶点的,也可以是同时作用于多个靶蛋白的。生物体(细胞、组织等)蛋白质组的所有蛋白质经化学小分子处理前后的差异蛋白质组展示(proteomeprofiling),可以用来研究这种相互作用。差异蛋白质组展示可借用目前常规的蛋白质组学技术。具体流程可简述为:化学小分子处理生物体蛋白质组样品→二维凝胶电泳(2-DE)分离蛋白质组分→2-DE图像分析找出与化学小分子处理相关的差示蛋白质斑点→从胶上切下这些蛋白质斑点并做酶解→生物质谱分析酶解后的多肽混和物→生物信息学手段鉴定和表征蛋白质→分析解释数据。例如,Anderson等研究了抑制素类降胆固醇化合物对小鼠肝脏蛋白质组的影响,通过对比和分析药物治疗前后的2-DE蛋白质组展示,发现该化合物作用的靶蛋白质为HMG-CoA合成酶(胆固醇合成途径的关键酶之一),从而阐明了该类化合物降胆固醇作用的分子机理。近来,这种差异蛋白质组展示技术有新的发展。Amersham公司最近发明了荧光差异二维电泳技术(DIGE),该技术利用化学小分子的特异标记荧光探针(如Cy3和Cy5)在跑胶前分别标记两种蛋白质组样品(如药物处理和未处理样品),或通过第三种荧光标记(如Cy2)在所有样品中引入内标(normalization)。标记后,所有样品预先混和再一起上样跑胶,这样就可以在同一块胶比较蛋白质组的展示差异,大大克服了通常二维电泳胶与胶之间的系统误差;又通过荧光检测,提高了分析灵敏度和定量动态范围。而且,小分子荧光探针的微量标记基本不影响原有蛋白质2-DE模式和此后的质谱分析。另一种基于液相色谱的定量蛋白质组技术ICAT(isotope-codedaffinitytag)则是通过引入同位素标签的化学小分子探针标记蛋白质组(含半胱氨酸功能基团的蛋白质)来精确定量差异展示蛋白质组的。具体可参看文献,限于本文篇幅和重点,在此不详述。除用于蛋白质新靶点的发现和药物作用机理研究外,化学蛋白质组学今后还可用于活性先导化合物的跟踪筛选。目前,随着组合化学和天然产物化学的成熟,大量新化合物的提供已经不是新药研发中的问题。但是,跟踪筛选技术的相对滞后,使得活性先导化合物的发现和优化,成为新药研发的最大瓶颈。目前的筛选手段大多必须预先了解药物作用的机制并有成熟的测活方法,而且一次只能使用一种与目标疾病对应的药理筛选指标。但是,多数新的先导化合物,其药理活性都是不可预知的;即便有预见的活性信息,很多时候也没有灵敏方便的测活方法可供追踪筛选。而基于蛋白质组学的新药筛选技术,无需以建立特定的生物活性测试方法为前提,只需通过同时观测化合物处理前后细胞/组织样品中数千种蛋白质表达的变化,并随后鉴定和分析这些与化合物处理相关的变化蛋白,就可高效地抽取化合物的活性信息。有别于传统的以生物活性测试为中心的筛选技术,这是以蛋白质序列鉴定和发现为中心的反向筛选技术。如能在待筛选的小分子化学库或其扰动的蛋白质组中引入特异的标记物,用于随后的亲和层析分离和随后的检测,将使这种方法更为高效简便。2.化学小分子探针检测功能蛋白质组人类蛋白质组总数庞大(20—200万),即使其中特定细胞的蛋白质组,在一定条件下表达的蛋白质数量也有数千种之多。但多数情况下,研究人员只是希望在蛋白质组的整体水平上研究其中某些感兴趣的功能蛋白质。尽管科学家们从一开始就意识到功能蛋白质组学的重要性,但却苦于没有很好的手段能够真正切入功能蛋白质组的研究。近年来,美国Scripps研究所的Cravatt小组发展了一种新的化学蛋白质组技术:利用基于靶酶活性的特异化学小分子探针(activity-basedprobes,ABPs)来探测功能蛋白质组。该技术的原理是:合成同时带有反应基团和标签基团的ABPs试剂与待研究的蛋白质组作用(ABPs中的反应基团能够特异性共价修饰蛋白质组中的某类酶蛋白而将化学小分子“挂”到感兴趣的靶酶上,然后,利用ABPs中的荧光或生物素标签基团又可将这些靶酶一个个地从蛋白质组中“钓”出来)。由于ABPs是针对待研究靶酶的活性而定向设计的化学小分子,因而能够直接检测蛋白质组中感兴趣的靶酶的活性。目前,该方法已成功地分别用于针对丝氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、去泛蛋白化酶等靶酶的功能蛋白质组研究,并从中发现了一些化学小分子体内作用的疾病相关新靶点。最近,该方法又进一步扩展:化学小分子探针不仅可以是靶酶的不可逆抑制剂,还可以是可逆抑制剂。今后,这种方法有望扩展于针对所有靶蛋白质的功能蛋白质组研究,并可用于新药筛选。利用这种化学蛋白质组学手段,Bogyo研究组在细胞水平上“化学基因敲除(chemicalknockout)”了疟原虫入侵寄主过程中的重要功能蛋白质falcipain1,并在此基础上详细阐明了该蛋白的体内生物学功能。相对经典的遗传学基因敲除手段,“化学基因敲除法”具有快速、可逆、敲除力度可调控(随化学小分子浓度变化)、条件性敲除(可在发育过程的特定阶段随时引入)、可针对蛋白质的特定结构域进行特异性敲除(避免补偿机制)等优点。3.蛋白质的磷酸化修饰蛋白质的磷酸化和去磷酸是所有细胞过程中最常见的翻译后修饰(磷酸化修饰蛋白约占人类基因组编码蛋白的1/3),在细胞信号转导和生理病理中起着异常重要的作用,因而表征细胞中蛋白质翻译后的磷酸化修饰具有重要意义。传统的蛋白质磷酸化检测方法(无机磷酸盐代谢同位素标记、固定化金属亲和层析、磷酸化抗体等)是蛋白质磷酸化研究的重要手段,但这些传统手段用于蛋白质组水平的磷酸化研究,则各有局限性。最近,利用特异化学标记和转化而发展的蛋白质组磷酸化技术取得了较大进展:如,通过碱催化的磷酸酯消除或氨基磷酸酯修饰,反应可对混和蛋白质组样品中的磷酸化蛋白质引入特异的化学标签,从而方便地富集这些含化学标记的磷酸化蛋白,随后利用生物质谱可对磷酸化水平和磷酸化位点进行深入的结构表征和定量分析。4.小分子/蛋白质的相互作用化学蛋白质组学一个新兴起的方向是:利用微阵列蛋白质芯片研究化学小分子与蛋白质的相互作用。与微阵列基因芯片类似,蛋白质芯片技术利用机器人自动化点样装置将极微量的纯化蛋白(可多达上千种)高密度地点在表面预先处理过的玻片等固相载体上(玻片上预先覆盖的抗体或化学交联剂等可将点样的蛋白质固定化并保留其生物活性)。这样制备好的蛋白质芯片可用来俘获与芯片上的点样蛋白有相互作用的小分子化合物,最后通过被俘获小分子上偶联的荧光剂检测这种相互作用。显而易见,这种技术的优点是,一次反应就可同时大规模平行检测蛋白质与其配体之间的相互作用,而且仅消耗极微量的样品并容易实现自动化,因而理论上特别适合蛋白质组水平上的小分子/蛋白质的相互作用研究。美国哈佛大学化学与细胞生物学研究所的年轻科学家McBeath博士是这方面工作的领先者之一。McBeath应用该技术检测了已知的三对小分子/蛋白质的相互作用(毛地黄毒苷/小鼠单克隆抗体DI-22、生物素/链霉抗生物素蛋白、哌啶T酮酰胺/免疫亲合蛋白FKBP12)。具体地说,McBeath利用乙醛硅烷化试剂将上述三种蛋白质西夫氏交联固定于玻片制成蛋白质芯片,成功地检测到分别偶联了不同荧光剂的相应配体化合物。此外,McBeath还在尝试将这种方法用于组合化学合成的大量小分子化合物与靶蛋白的相互作用研究。加州大学Davis分校的Lam研究组则将小分子组合化学库化合物高密度分别点样在芯片上,制成化学微阵列芯片(chemicalmicroarray),即“配体芯片”,并用其来研究相应的蛋白质组。耶鲁大学的Snyder研究组则应用蛋白质组芯片(由5800余种克隆表达的酵母蛋白制成)检测蛋白质与磷脂的相互作用。此外,微阵列蛋白质芯片也可用于从血样或细胞裂解液等蛋白混和样品中特异性地检测微量活性蛋白,用于临床诊断治疗。尽管蛋白质芯片技术前景诱人,但从目前的进展看,这方面的研究还困难重重。主要是,与基因微阵列芯片相比,蛋白质目前还没有PCR那样的有效克隆手段,因而大规模制备纯化芯片点样蛋白是最大的瓶颈;而且,蛋白质的功能取决于其三维结构的完整性,对大量性质不同的蛋白质如何平行处理后仍在芯片上保留各自的生物活性也是一大难题;还有,基于蛋白质芯片的检测手段也有待提高。尽管这样,利用蛋白质芯片在蛋白质组