章蛋白质的功能与进化教学用

一、蛋白质功能的多样性(自学)

二、血红蛋白的结构

三、血红蛋白的功能：转运氧

四、血红蛋白分子病

五、免疫球蛋白

六、氨基酸序列与生物学功能

教学内容二、血红蛋白的结构光合作用→大气变化→氧气不断增加→生物进化到以氧为基础的代谢。进化中出现了两种重要的氧结合蛋白：肌红蛋白、血红蛋白肌红蛋白适合氧的贮存、血红蛋白适合氧的运输(一)血红素

(二)珠蛋白的三级结构

(三)与O2结合的机制

(四)血红蛋白的四级结构二、血红蛋白的结构肌红蛋白和血红蛋白的辅基(一)血红素原卟啉Ⅸ血红素，原卟啉Ⅸ与还原型Fe2+的络合物(二)珠蛋白的三级结构肌红蛋白（Mb）：

单体蛋白,一条多肽链和一个血红素辅基构成,Mr17000,153个氨基酸残基。Mb的脱辅基蛋白质称为珠蛋白（globin）。Mb主链：8个α螺旋区段，分别命名为A、B、C…H；相应的非螺旋区段(也称拐弯)为NA(N-末端区段)、AB、BC…FG、GH、HC（C-末端区段）。氨基酸残基两种表示法：HisF8,即从N端开始His93(二)珠蛋白的三级结构血红素结合部位除内衬一层疏水残基外，还有两个His残基，HisE7和HisF8，它们在氧结合中起关键的作用。(二)珠蛋白的三级结构HisF8,为近端组氨酸，其咪唑N成为血红素Fe(Ⅱ)的第5配体。当肌红蛋白与氧结合变成氧合肌红蛋白（oxymyoglobin，MbO2）时,Fe(Ⅱ)的第6配位被O2占据。(二)珠蛋白的三级结构HisE7,为远端组氨醯(distalHis)，在血红素基与氧结合的一侧,离血红素稍远，不与Fe(Ⅱ)成键，与O2分子紧密接触，使O2轴不能垂直于环平面，约有60°的倾斜，因此氧结合部位是一个空间位阻区域。(三)与O2结合的机制水中游离的血红素也能与氧结合，但血红素Fe(Ⅱ)被氧化成高铁血红素Fe(Ⅲ)。肌红蛋白的疏水空穴中，可以避免与水接触，使血红素Fe(Ⅱ)不易被氧化。当与O2结合时发生暂时性电子重排，去氧后铁仍处于亚铁态。血红素-血红素作用增强Fe(Ⅱ)的氧化,珠蛋白氧结合部位的空间位阻使两个血红素基团不能靠足够近,不易发生这种相互作用。空间位阻也降低血红素对CO的亲和力，游离的血红素结合CO比结合O2的能力强25000倍，而珠蛋白中血红素对CO的亲和力仅为对O2的250倍。肌红蛋白和血红蛋白凭借位阻降低了对CO的亲和力，有效地防止代谢过程中产生的少量CO的毒害。空气中CO含量达0.06%～0.08%即有中毒危险,达0.1%则使人窒息死亡。Fe(Ⅱ)离子向卟啉环上方突出0.06nmFe(Ⅱ)离子仅向卟啉环上方突出0.02nm，同时牵引F螺旋移动，引起肌红蛋白构象变化。2个α亚基和2个β亚基杂四聚体,近球形(6.4nm×5.5×5.0nm)，也可看成由两个原聚体(αβ)构成的对称二聚体。(四)血红蛋白(Hb)的四级结构去血红素的α亚基和β亚基也属于珠蛋白家族，α-珠蛋白(141个残基)和β珠强白(146个残基)。Hb含4个血红素，能结合4个O2。Hb中作为氧结合部位的空穴与Mb中的极相似,它们都有两个关键的His残基(E7和F8)和两个疏水残基(PheCDl和LeuF4)。(四)血红蛋白(Hb)的四级结构和Mb一样，Hb上的氧结合部位也能可逆地与O2结合而不使Fe(Ⅱ)氧化，并且也降低了血红素与CO的亲和力。Hb的四级结构带来Mb没有的两个结构特点：(四)血红蛋白(Hb)的四级结构β2亚基缔合出现一个中央空穴，为BPG结合部位。α1α2β1特点一：装配接触：蓝色部分滑动接触：黄色部分特点二：出现亚基之间相互作用区域，特别是α和β之间的接触界面。α和β接触有两种：Hb半分子（α1β1和α2β2）中α和β的接触为装配接触；半分子之间的α和β接触（α1和β2、α2和β1）

，滑动接触一、蛋白质功能的多样性(自学)

二、血红蛋白的结构

三、血红蛋白的功能：转运氧

四、血红蛋白分子病

五、免疫球蛋白

六、氨基酸序列与生物学功能

教学内容(一)肌红蛋白是氧的贮库

(二)血红蛋白氧合的协同性和别构效应

(三)血红蛋白的两种构象状态：R态和T态

(四)血红蛋白协同性氧结合的定量分析

(五)BPG调节Hb对O2的亲和力

(六)H＋和CO2调节Hb对O2的亲和力：Bohr效应

三、血红蛋白的功能：转运氧(一)肌红蛋白是氧的贮库Mb与O2结合的化学计量关系：氧解离平衡常数：[MbO2]与[Mb]之比与[O2]成正比或(一)肌红蛋白是氧的贮库氧分数饱和度Y或根据Henry定律，溶于液体的任一气体的浓度与液体上面的该气体分压成正比：另一种表达Mb与O2的结合的化学计量关系：P(O2)：可被调节和测量，单位kPa（1kPa=7.5torr或mmHg）Y：分光光度法测量氧结合曲线或氧解离曲线当Y=1时，饱和当Y

=0.5时,p(O2)=K=P50或P0.5P50的定义：肌红蛋白被氧半饱和时的氧分压用氧分压和氧分数饱和度作图：Mb的氧结合曲线是一等轴双曲线氧结合曲线或氧解离曲线Mb的P50为0.27kPa肌肉毛细血管中氧浓度约为3kPa；细胞内表面约为1.33kPa（Mb80%被饱和）；线粒体中为0~1.33kPa（Mb25%被饱和）；

结论：大多数情况，Mb是高度氧合的，氧的贮存库，有利于细胞内的O2从质膜向线粒体运转Hb，四聚体，通过亚基-亚基相互作用调节它的氧合能力→引出别构效应概念别构效应(allostericeffect)：又称为变构效应。多亚基蛋白质一般有多个配体结合部位。一个配体与蛋白质上的一个结合部位的结合影响同一蛋白质上其他结合部位的亲和力称别构效应。具有别构效应的蛋白质称为别构蛋白质,如血红蛋白。别构（或变构），原指蛋白质分子不止含有正常配体结合部位(如活性部位)，尚有别的配体如调节物或效应物结合部位——调节部位或别构部位。别构蛋白质的调节物可以是激活剂或抑制剂。（二）血红蛋白氧合的协同性和别构效应别构效应：有同促[别够]效应和异促[别够]效应两种情形同促[别构]效应：调节物和正常配体是同一种分子，发生相互作用的部位是同种的，一个配体的结合影响同种配体与其余同种空位的结合能力，一般使亲和力加强——具有协同性或正协同性。正协同[同促]效应表现为S形配体结合曲线，正协同结合使蛋白质对配体浓度的应答更为敏感。负协同[同促]效应，它不呈现S形曲线。（二）血红蛋白氧合的协同性和别构效应异促效应：调节物是正常配体以外的分子，发生作用的部位不是同种的，即正常配体的结合行为受到另一种配体(调节物)与另一种部位(别构部位)结合的影响。血红蛋白有正常配体结合部位和调节物结合部位,既有同促效应又有异促效应。O2

可被认为是Hb的正常配体又是同促调节物，BPG是异促调节物。（二）血红蛋白氧合的协同性和别构效应(三)血红蛋白的两种构象状态：R态和T态Hb有两种可结合氧的互变的构象状态，T态、R态。T态，去氧Hb主要构象；R态，氧合Hb主要构象。(三)血红蛋白的两种构象状态：R态和T态8个盐桥Bothα-andβ-subunitshaveTyrasthepenultimateC-terminalresidue(Tyr140＝TyrHC2;Tyr145＝TyrHC2，respectively)。酪氨酸-OH与ValFG5(ValFG5isα93andβ98，respectively)形成氢键；缺氧时T态的被稳定：(三)血红蛋白的两种构象状态：R态和T态TheshiftinhelixFuponoxygenationleadstoruptureofthisTyrHC2:ValFG5hydrogenbond.Further,eightsaltbridgeslinkingthepolypeptidechainsarebrokenashemoglobingoesfromthedeoxytotheoxyformHb半分的彼此滑动、旋转，使β亚基之间的空穴变窄，致使BPG，进入R状态，O2被结合有氧时，O2与T态Hb结合→：1910，HillA对血红蛋白与O2的协同性结合作过定量分析。暂设O2与Bb的结合是一种“全或无”的现象。(四)血红蛋白协同性氧结合的定量分析则解离平衡常数:Hb的氧分数饱和度：或两边取负对数：Hill方程对作图，Hill作图根据方程，Hill图应有个n的斜率。但测得的斜率反映的不是氧结合部位的数目，而是部位之间相互作用的程度。故Hill图的斜率用nH表示，即Hill系数，是协同程度的量度。(四)血红蛋白协同性氧结合的定量分析若n=1，配体结合非协同，如肌红蛋白。若nH＞1，正协同，血红蛋白。若nH=n，即nH达到理论极限，配体结合完全协同。但实测nH总小于蛋白质中的配体结合部位数。若nH＜1，负协同，也即一个配体的结合导致后续配体更难结合，但例子很少。(四)血红蛋白协同性氧结合的定量分析Hb的nH＝2.8，在nH

＝1和nH＝4两极端之间，表明Hb和O2的结合是高度协同的，但不完全协同，因n个O2在一瞬间结合到同一Hb分子的概率几乎等于零.(四)血红蛋白协同性氧结合的定量分析第一个亚基和氧结合情况第四个亚基和氧结合情况Hb：肺泡中Y=0.97，肌肉毛细血管中Y=0.25。释放的氧的△Y=0.72。

△Y:血红蛋白输氧效率的指标。协同性将增加△Y值。如果是肌红蛋白：从肺泡输氧到肌肉，虽然p(O2)有相的改变，但△Y不到0.1，表明Mb不适合于担当从肺部到组织转运氧的角色.肺泡中的p(O2)约为13kPa；肌肉毛细血管中p(O2)约3kPa。Hb适合运输氧的原因：(五)BPG调节Hb对O2的亲和力BPG，Hb的负异促效应物或称别构抑制剂。BPG与Hb作用是异促别构调节的实例。正常红细胞约含4.5mmol/LBPG，和Hb等摩尔数，BPG部位在亚基形成的中央孔穴。高负电荷BPG把两β链交联在一起。Hb分离提取后，仍结合相当量的BPG，很难完全被除去。α1α2β1β2Lysβ82（EF6）Hisβ2（NA2）Hisβ143（H21）Valβ1（NA1）Valβ1（NA1）Hisβ143（H21）Hisβ2（NA2）Lysβ82（EF6）(五)BPG调节Hb对O2的亲和力BPG和β链之间的离子键有助于稳定T态的Hb构象，促进氧的释放。变为R态时，Hb中央孔穴变小,容纳不了BPG，因O2的结合引起Hb构象变化，扰乱了BPG的结合部位。O2和BPG与Hb的结合互相排斥。BPG：肌肉组织代谢产生。α1α2β1β2Lysβ82（EF6）Hisβ2（NA2）Hisβ143（H21）Valβ1（NA1）Valβ1（NA1）Hisβ143（H21）Hisβ2（NA2）Lysβ82（EF6）Y△Y△Y△Y4.5mmol/L7.5mmol/L完全脱BPG的Hb对O2的亲和力很高，能在4kPap(O2)下为O2所饱和，几乎不释放氧，氧结合曲线呈双曲线形式。BPG对Hb样合曲线的影响Y△Y△Y△Y4.5mmol/L7.5mmol/L肺部p(O2)大于13kPa，Hb几乎全被O2饱和，BPG与氧合关系不大。外周组织p(O2)低(<4kPa)，如无BPG，就会减少Hb对组织的氧供应。有BPG(4.5mmol/L)的存在，Hb对O2的亲和力低，氧结合曲线呈现正常的S形曲线，供给组织的氧量(卸氧量)约为血液所能携带的最大氧量的40%(△Y)。BPG对Hb样合曲线的影响Y△Y△Y△Y4.5mmol/L7.5mmol/L常人在短时间内由海平面升到海拔4500m高山时，红细胞中的BPG浓度几小时后就开始上升，两天内可由4.5mmol/L增到7.5mmol/L.释氧从30%提高约40%BPG对Hb样合曲线的影响CO2和H+组织呼吸产生的两个终产物。CO2水中的溶解度很小，容易形成气泡。红细胞含丰富的碳酸酐酶，催化CO2和水生成HCO3-和H+。呼吸产生的CO2约70%～80%以HCO3-的形式转运到肺部.CO2水合增加了组织中的H+浓度。CO2也能和Hb氨基末端

α-NH2共价结合生成氨基甲酸Hb(Hb-NHCOO-),约20%CO2以此形式转运到肺部；同时也产生H+，进一步降低组织中pH。Hb与O2结合和与H+(或CO2)结合是相拮抗的.[H+]↑将提高O2释放。(六)H+和CO2调节Hb对O2的亲和力:Bohr效应(六)H+和CO2调节Hb对O2的亲和力:Bohr效应Bohr效应：当H+浓度增加时，Hb氧分数饱和度曲线右移。pH对Hb氧亲和力的影响，因丹麦生理学家BohrG发现而得名。pH对Hb氧分数饱和度曲线的影响：肺中血液pH7.6，组织中pH7.2，氧结合实验常在pH7.4下进行血液流经组织时，这里的pH较低，[CO2]较高，使组织能比单纯p(O2)降低获得更多的氧，而氧的释放又促使Hb与H+和CO2的结合，以补偿由于组织呼吸引起的pH降低，起着缓冲血液pH的作用。血液流经肺部时,这里p(O2)高，有利于血红蛋白与氧的结合，促进H+和CO2的释放，同时CO2呼出又有利于氧合Hb的生成。Bohr效应的生理意义：(一)镰状细胞贫血病

(二)α-和β-地中海贫血四、血红蛋白分子病血红蛋白病(hemoglobinopathy)，α或β链发生了变化，例如镰状细胞贫血病等；地中海贫血(thalassemia)，缺少了α或β链，例如α-和β-地中海贫血病。Hb分子病可分为两类：(一)

镰状细胞贫血病GluVal非洲的某些地区发病率非常高。Hb量仅为正常人(15~16g/100mL)的一半，红细胞数目也是正常人的一半左右.Val侧链：“粘性”突起与Phe

β85、Leuβ88形成的互补口袋借疏水作用形成纤维状结晶，使红细胞弯成镰刀状，不易通过毛细血管，因而血流变慢，导致组织缺血受伤，影响器官正常功能镰状细胞贫血病发病机制：缺失一个或多个编码血红蛋白链的基因;所有基因都可能存在,但一个或多个基因发生无义突变,结果产生缩短了的蛋白链,或发生移码突变,致使合成的链含不正确的氨基酸序列;所有基因都可能存在,但突变发生在编码区之外,导致转录被阻断或前体mRNA的不正确加工。(二)α-和β-地中海贫血产生途径:(二)α-和β-地中海贫血β-地中海贫血：β-珠蛋白基因丢失或不能表达，此缺损的纯合子个体将产生严重的症状。患者不能制造β链，必须依赖胎γ链的继续产生以形成有功能的血红蛋白(Hb

F)。γ链的产生可以继续到童年，但多数不到成熟就夭折了.杂合子患者症状较轻，这种人有一个β基因仍是正常的，β-地中海贫血性状。(二)α-和β-地中海贫血α-地中海贫血:在每个染色体上有两个邻接的拷贝(α1和α2)，它们的蛋白质产物只差一个氨基酸残基，并且都是有功能的，因此一个人可以有4、3、2、1或0个α基因拷贝。含4个拷贝是正常的，仅含1个拷贝的可能表现出轻微的症状，即α-地中悔贫血性状。

0个拷贝则是致命性的，称为α-地中海贫血。α-珠蛋白链的水平低下时，将形成同四聚体:β4或γ4等。同四聚体能结合O2，但无协同性或无别构效应，因此不能发挥正常的功能。(一)免疫系统(自学)

(二)免疫球蛋白的结构和类别

(三)基于抗体一抗原相互作用的生化分析方法五、免疫球蛋白(一)免疫系统(自学)Thetablesummarizesthefunctionsofthevariousleukocytesoftheimmunesystem体液免疫细胞免疫抗原抗体抗原决定簇（表位）MoleculesofMr<5,000aregenerallynotantigenic(二)免疫球蛋白的结构和类别免疫球蛋白(抗体),可溶性血清糖蛋白，血清中最丰富的蛋白质之一。抗体具有两个显著的特点：高度的特异性;庞大的多样性。特异性：一种特定的抗体只能与引起它产生的相应抗原发生反应。多样性：抗体可以和成千上万种抗原(天然的和人工的)起反应。Y形结构；4条链：二重、二轻。抗体分子(IgG)二价；抗原分子可以是多价的。价数：抗原与抗体结合部位数目。当抗体和抗原接近等物质的量(称为等价带)浓度时，将发生最大的交联，产生最大量的免疫沉淀或沉淀素体外沉淀反应广泛用于研究抗原-抗体反应，实验免疫学的基础。免疫球蛋白的结构免疫球蛋白的类别按照重链的类型分为:类别重链轻链IgGγ

κ或λIgAα

κ或λIgMμ

κ或λIgDδ

κ或λIgEε

κ或λEachclasshasacharacteristictypeofheavychain,denotedα、δ、ε、γandμforIgA,IgD,IgE,IgG,andIgM,respectively；Twotypesoflightchain,κandλ,occurinallclassesofimmunoglobulins.IgG记忆B细胞引发的再次免疫反应的主要抗体，可以通过胎盘。

IgA唾液、泪液、乳汁等分泌物的主要抗体，可单体、二聚体或三聚体。IgM初次免疫反应早期产生的，可以以单体形式与膜结合，或形成5聚体。IgD主要存在于B细胞表面，功能不详。IgE与过敏源结合诱导细胞产生组胺和其他活性胺，使血管扩张，渗透性增大，引起炎症反应。免疫球蛋白的类别JchainHevaychainLightchainIgM(三)基于抗体一抗原相互作用的生化分析方法Polyclonalantibodies

arethoseproducedbymanydifferentBlymphocytesrespondingtooneantigen,suchasaproteininjectedintoananimal.CellsinthepopulationofBlymphocytesproduceantibodiesthatbindspecific,differentepitopeswithintheantigen.Thus,polyclonalpreparationscontainamixtureofantibodiesthatrecognizedifferentpartsoftheprotein.Monoclonalantibodies,

incontrast,aresynthesizedbyapopulationofidenticalBcells(aclone)grownincellculture.Theseantibodiesarehomogeneous,allrecognizingthesameepitope.单克隆抗体的制备用选定的抗原免疫小鼠，取出脾脏，制备B淋巴细胞。培养小鼠的骨髓瘤细胞。B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合。转移到只有杂交瘤细胞才能生长的培养基上,培养选择杂交瘤细胞。用ELISA筛选产生特定单克隆抗体的杂交瘤细胞。用小鼠腹水或培养箱培养选出的杂交瘤细胞。纯化所需的单克隆抗体。酶联免疫吸附测定Coatsurfacewithsample(antigens).如HIVBlockunoccupiedsiteswithnonspecificprotein.如酪蛋白或牛血清白蛋白Incubatewithprimaryantibodyagainstspecificantigen.如抗HIV外壳蛋白的兔IGIncubatewithantibody-enzymecomplexthatbindsprimaryantibody.如辣根过氧化物酶标羊抗兔的抗抗体,即羊抗兔IgG或第二抗体Addsubstrate.如辣根故氧化物酶，加3,3′,5,5′-四甲基联苯胺Formationofcoloredproductindicatespresenceofspecificantigen.如是四甲基联苯胺则产物黄色，450nm有最大光吸收，量与待测抗原或抗体量成正比也称Western印迹，操作上类似用于核酸分析的Southern印