第一章-分离绪论

生物分离工程——绪论《生化分离工程》教材教材：生物分离工程(第二版).孙彦主编，化学工业出版社，2005参考书：生物分离原理及技术.欧阳平凯主编，化学工业出版社，1999成绩：平时成绩：20％期末：80％1.绪论生物化工BiochemicalEngineering化学工程学生物学1.1基本概念生物技术（biotechnology）

是指人们以生命科学为基础，结合工程技术手段和其他基础学科的科学原理，对生物体进行改造或加工生物原料，为人类生产出所需产品或提供服务的技术。生物工程，生化工程，生物化工，生物加工过程…生物技术

产品产品发酵酶催化分离基因工程、菌株选育生物分离工程简介生物分离技术(Bioseparation)：

对于由自然界天然生成的或由人工经微生物菌体发酵、动植物细胞培养及酶反应等各种生物工业生产过程获得的生物原料，经分离、纯化并精制其中目的成分，并最终使其成为产品的技术，也称为生物下游技术（DownstreamProcessing）。生物分离工程简介传承和特点：

生物分离工程是在传统化工分离的单元操作上发展起来的，但由于生物物质在许多方面与传统化工产品存在很大的差异，它又具有很多独特的性质和特点。应用：现在的生物分离工程技术已广泛应用于医药、发酵、食品、轻工等领域的产品分离及纯化。另外，环境工程中污水的净化与有效成分的回收，也常用生物分离技术。1.2生物分离技术研究简史1、古代酿造业

如果将生物技术定义为“直接或间接地利用生物体的机能来生产人类所需产品的技术”，生物技术产业的历史可以追溯到古代的酿造业（公元前4228年），它包括酿造、做面包、干酪、酸奶等。但是古代的生物技术比较原始粗糙，一般都是家庭作坊式的生产，大多数产物基本不经过分离而直接使用，因此也就没有专门的生物分离技术了。做豆腐蛋白沉淀、过滤、干燥、……2、第一代生物技术

第一代（传统）生物工业是指1860年代到1940年代青霉素等抗生素出现之前的生物技术产业。这一时期，发现了发酵的本质是微生物的作用，而且发现了微生物的有关功能，掌握了纯种培养技术，生物技术进入近代酿造产业的发展阶段。到20世纪上半叶，近代酿造产业的生产技术已经有了很大的发展，又逐渐开发形成了发酵法生产酒精、丙酮、丁醇等微生物发酵工业（厌氧发酵）。巴斯德"鹅颈瓶实验"

这个时期的生化产品相对比较简单，基本上是无活性的小分子（有机溶剂）。此时开始引入化学工程中较成熟的近代分离技术，如过滤、蒸馏、精馏等，生产多以经验为主。3、第二代生物技术

20世纪40年代出现的青霉素产品的出现是生物技术发展史上的里程碑，也是第二代生物技术的代表。这一时期，随着无菌空气制备技术和大型好氧发酵装置的开发成功，微生物发酵工业迅速壮大，一大批（好氧发酵）的产品相继投入了工业化生产，如链霉素等抗生素、谷氨酸等氨基酸、核酸（核苷酸）、柠檬酸等有机酸、淀粉酶等酶制剂、微生物多糖和单细胞蛋白等。图青霉素的发现者Flemming（A）和产黄青霉对病原细菌金黄色葡萄球菌的抑制(B)工业规模的深层发酵

产品的多样性对了分离方法提出了更高的要求，许多化学工程工作者加入了生物反应过程的行列中，一门反映生物与化工相交叉的学科——生化工程也于40年代诞生，并得到迅速发展。这期间借鉴和引进吸收了大量的近代化学工业的分离技术，约有80％的化工单元操作技术被引入生物工业。在60年代以前，生物技术产品的下游加工过程基本是套用化工单元操作或经过简单改造。这期间也产生了一些新的生化分离技术，但都还处于实验室研究阶段。4、第三代生物技术

20世纪70年代中期以来，随着基因工程、酶工程、细胞工程、微生物工程以及生化工程的迅速发展，特别是DNA重组技术及细胞融合技术等技术取得的重大突破，促使了大量的现代生物技术产品（如乙肝疫苗、干扰素等重组蛋白）的研究和开发，从而确定了第三代生物技术（现代生物技术）的地位。

此时生物技术在其各个主要领域都取得了长足进步，一大批对人类十分有益的高附加值的产品开始面世。80年代，国际上又兴起了对人类健康有益的生理“功能因子”的研究，发现了一大批生理功能性物质并推出了相应的产品，如低聚糖、活性肽、高度不饱和脂肪酸等，生物技术在深度和广度上都取得了很大的进展。表1国内外已商业化生产的现代生物技术产品举例产品类型产物名称动物细胞培养生产的产品乙肝疫苗，促红细胞生长素（EPO），β－干扰素，TPA植物细胞培养生产的产品人参皂甙，长春花碱，紫草宁，小蘗碱紫杉醇基因工程发酵产品人胰岛素，α－干扰素，人生长因子，人血白蛋白香港不少明星依靠注射内源性生长因子注射除皱(ACR)来保持青春

与此同时，人们注意到了下游分离技术对发展现代生物技术及其产业化的重要性，分离技术的落后会严重阻碍生物技术的发展。国内外纷纷加强对生物分离技术的研究力量，增设研究机构和加大资金投入，一些公司和生产企业也在生物分离技术领域展开竞争。1.3生物产品与生物分离生物产品的一个主要特点：种类繁多（分离方法的多样性）按用途分类

食品与精细化学品：食品添加剂（果葡糖浆、维生素）、化妆品（透明质酸）

医用类产品：疫苗、抗生素、重组医用蛋白等

农业用产品：兽用抗生素、生物农药、饲料等

生物试剂类

其他生物产品（生物柴油、生物材料PHB）等香港不少明星依靠注射内源性生长因子注射除皱(ACR)来保持青春按分子量大小分类

MW<1000Da：抗生素、有机酸、氨基酸、多肽类等

MW>1000Da：酶、抗原、抗体、多肽、蛋白质、核酸类按目的产物所在的位置分类

胞内产品：胰岛素、白细胞介素、干扰素、重组蛋白质

胞外产品：抗生素（青霉素、红霉素）、胞外酶（α-淀粉酶）等

细胞产品：酵母、单细胞蛋白生物分离过程的一般流程原料液细胞固-液分离溶液细胞破碎包涵体溶解复性粗分离纯化与精制成品化产品胞外产物胞内产物固-液分离溶液细胞碎片1.4生物分离的特点分离对象的特征：

传统的生物化学工业的主要对象（如通过发酵生产的有机溶剂、氨基酸、有机酸和抗生素等）是小分子生物物质，如氨基酸、酒精、有机酸等，产品的性质相对比较稳定。现代生物技术工业的产品（如用重组DNA技术生产的医用蛋白质和多肽等）具有生物活性，其稳定性受pH、温度、离子强度、提取过程所使用的溶剂和表面活性剂、金属离子等各方面因素的影响，有些生物产品甚至对剪切力很敏感，产品的分子量越大，其稳定性就越差，分离纯化的条件必须非常温和。一些产物组分的浓度非常低，但其产品的纯度却要求很高，含量常常要达到95％甚至98％以上。如果是医用药物还应具有正常的颜色、稳定性和溶解速率等性质。发酵液的主要特征：产物浓度较低（见下页表），并含有大量的水分；(2)是一个复杂的多相体系，含有菌体、未消耗尽的固体培养基等固体成分和大量的液相；(3)未消耗完的培养基成分，包括各种无机盐和有机物；(4)除所需产物外，还含有其他副产物以及色素等杂质，有些杂质的性质与产物很接近；(5)发酵液容易被杂菌污染，产物可能被微生物或酶降解；(6)发酵液粘度较大，浓缩时起泡现象严重；(7)所需要的发酵产物，有的存在于发酵液中，也有的存在于细胞或菌体内。表2几种典型发酵液组分含量产物干重量浓度，％细菌或酵母3~5真菌（柠檬酸、青霉素生产）1.5~3动物细胞（动物组织培养）0.05~5植物组织培养0.1~5酶0.5~1.0r-DNA蛋白质~1抗体1~5抗生素2~5氨基酸5~10有机酸5~10维生素0.005~0.1乙醇7~12生物产品的分离过程有以下特点：分离的对象组成复杂，发酵液或培养液是复杂的多相体系，料液粘度大，固液密度差小，固液分离难度较大；许多发酵产品具有生理活性，很容易变性失活，遇热、极端pH值、有机溶剂会引起失活或分解，特别是蛋白质的生物活性与一些辅因子、金属离子的存在和分子的空间构型有关。甚至剪切力也会影响空间构型和使分子降解，对蛋白质的活性有很大影响，因此，分离过程中的pH值、温度和搅拌等条件必须特别注意；目的产物和其它代谢产物种类多，理化性质复杂，很难通过单一手段将产物分离和纯化；发酵液中生物产品的浓度很低，而杂质含量却很高，这使分离所需能量以及产品价格大大提高，产品浓度与产品价格的关系见下页图；许多生物产品要求达到的纯度较高，尤其是用于医疗用途的产品；6.微生物发酵或酶催化反应多采取分批操作，各批料液不尽相同，要求下游加工有一定的弹性，对不同批号的料液都要能处理。发酵液的放罐时间、发酵过程中加入的消泡剂对提取产物都会有影响。由于发酵产物大多是不稳定的，故快速操作往往对保证有效地回收和纯化产物非常关键。图发酵液中产品浓度C与产品价格P的关系1984年，每千克生物产品售价P与原料液中目标产物浓度C的双对数坐标图，从图可知，P和C的关系可近似表示为CP＝k（常数），或P＝k/C

所有这些因素都使得生化产物的分离提纯具有相当大的难度。从以上分析可以看出，与传统化学工业的分离对象相比，生化工业的分离对象是一个相对更为复杂的体系，有着许多自身的特点。因此生物分离过程的操作也有着自身的特点，不能简单套用化工的单元操作。1.5分离技术和原理分离原理：利用目标产物与共存杂质之间在物理、化学以及生物学性质上的差别，使其在分离操作中具有不同的传质速率和（或）平衡状态。物理性质力学性质

密度、形状、尺寸离心、膜分离（筛分）热力学性质

溶解度（固液平衡）、挥发度、相平衡

萃取、蒸馏、结晶与沉淀、吸附和离子交换、色谱等传质性质

黏度、扩散

电磁性质

荷电性质、等电点、磁性

电泳、电渗析、离子交换化学性质化学热力学（化学平衡）、反应动力学（反应速率）

化学吸附、化学吸收生物学性质生物分子间的分子识别作用

亲和色谱分离技术分类（两大类）：（1）平衡分离

溶质在两相间分配平衡差异分离。达到平衡的推动力为溶质偏离平衡态的浓度差，为扩散传质过程。

萃取、结晶与沉淀、吸附与离子交换(色谱)等。

（2）差速分离利用外力（离心力、压力、电场）驱动溶质迁移产生的速度差进行分离。电泳、超滤、离心等。1.6分离效率的评价分离目的：生物活性不受或少受影响，满足纯度和回收率的要求，成本低（高效分离）。1.分离方法和设备角度分离容量（capacity）

单位体积分离设备处理料液或目的产物的体积或质量分离速度（speed）

单批次分离所需的时间，或分离过程的进料速度分辩率（resolution）

目标产品的纯化效果或杂质的去除能力2.分离过程和产品角度浓缩程度分离纯化程度回收率分离过程原料CFCcTC,cXC产品P废料WFPcTP,cXPFWcTW,cXW浓缩率分离因子平衡过程分离(纯化)因子Purificationfactor分离过程原料C(比活AC)产品P(比活AP)废料WA:U/mg分离过程原料CFCcTC,cXC产品P废料WFPcTP,cXPa:

单位体积溶液目标产品活性（U/mL或U/L）回收率recovery间歇操作连续操作1.7生物分离的一般流程①发酵液的预处理（Pretreatment）和固液分离

经过加热、调pH、添加絮凝剂等方法对发酵液进行预处理后，经常采用过滤和离心这两个单元操作进行固液分离。如果产品在细胞内，那么这一步中往往还包括细胞的破碎以释放产品操作，这个过程通常是在进行固液分离之后进行的，这样可以减少分离体系的体积(相应增加产品浓度)。由于产品释放之后体系中又同时存在有固体和可溶物（产品），因此需要再增加一步固液分离以除去细胞碎片。

这个阶段的主要任务是去除（或收集）发酵液中的固相物质，为后续的几个过程提供澄清的原料液体。经过这一步操作，产物的浓度或品质一般不会有太大的改善。板框过滤机离心机②产品分离及初步纯化（isolation）

在这一步中，需要除去与目标产物性质差异较大的杂质并对产品进行浓缩。对于不同性质产品，根据其各自的特点采用不同的方法进行分离，沉淀、吸附和萃取是这个步骤中的典型操作。这个步骤往往是由许多个单元操作组合起来的多级加工过程，经过处理，产品的浓度（或纯度）有较大变化。超临界流体萃取树脂吸附③纯化和精制（purification）

这步中所用得技术对产品的针对性（选择性）较强，能够除去与产品的物理性质或化学功能类似的一些杂质。色谱、电泳、结晶是很好的一些纯化方法，产品的品质也能得到很大的提高。结晶层析④成品加工（polishing）

根据产品应用时的要求，在产物经过提取和精制后，一般还需要一些加工步骤。例如浓缩、无菌过滤和去热原、干燥、加入稳定剂等。膜分离（浓缩、去热原）冷冻干燥机

抗生素的生产过程是一个典型的生化分离过程，包括以上四个步骤，如表3所示。产品的浓度在分离（初步纯化）过程中增加幅度最大，但产品的纯度却是在纯化过程中提高最多。表3典型生物制品分离过程示例步骤典型过程产品浓度（克/升）纯度（％）发酵液获得去除不溶物分离纯化精制发酵过滤萃取色谱结晶0.1-51.0-55-5050-20050-2000.1-1.00.2-2.01-1050-8090-100发酵液预处理（加热、调pH、絮凝）收集上清液或蛋白质包含体细胞分离（沉降、离心、过滤）细胞碎片分离（离心、过滤、萃取）细胞破碎（高压匀浆、研磨、溶菌处理）初步纯化（沉淀、吸附、萃取、超滤）高度纯化（亲和分离、层析、电泳、结晶）成品加工（超滤、结晶、干燥）细胞清液（含胞外产品）灭活处理细胞1.8生物分离过程的选择准则

（1）产物的特性

产物是在胞内还是在胞外→是否需要细胞破碎以及选用哪种破碎方法?细胞破碎过程中产品的收率和活性的保留!

发酵液中产物浓度的高低对分离工艺选择的影响很大，如果产物浓度很低，往往需要首先进行产物的浓缩以提高后续操作的有效性；对于分离原料的特性必须认真对待。我国许多大的生物技术产业（如酒精、柠檬酸、酶制剂等工业）以粗料发酵为主，粗原料中带入的大量未参与发酵的可溶性杂质和不溶性悬浮物，会给下游过程的分离提取带来很大困难，并且使操作成本大大增加。发酵液中的杂质种类很大程度上影响到工艺的选择，根据杂质与产物性质差异的类型能够方便的选择分离方法进行产物的分离或杂质的去除；

所需分离产物物性对于分离过程的设计是必需的：根据产物的溶解度可以考察各种方法中pH、温度等条件对沉淀过程或萃取过程的影响；根据分子带电性质可以采用何种离子交换介质进行分离；根据分子大小的不同可以采用膜过滤或凝胶过滤层析将产物与杂质进行分离；生化产品有包括像乙醇、乳酸、醋酸那样的小分子物质，性质比较稳定，也有酶、蛋白质、激素等相对分子量较大的具有生物活性的大分子，其活性易受温度、pH值、金属离子、无机盐浓度、有机溶剂等环境的影响，即产品的稳定性制约了下游技术的可选范围。因此产物的理化特性(生物活性、稳定性等)决定了分离过程是否可以采用粗放型、低成本的分离方法（如萃取、蒸发等），还是需要充分注意分离过程中的pH、温度、溶剂等条件对产物活性的影响。图根据主要分离因素排列的单元操作分离范围(2)产物的用途、形式及其最低纯度标准