第三章 DNA的复制

第三章DNA复制(DNAReplication)

3.1复制的机理3.2复制的过程3.3复制的酶学3.4复制的形式3.5复制的调控

定义：亲代双链DNA分子在DNA聚合酶的作用下，分别以每单链DNA分子为模板，聚合与自身碱基互补配对的游离的dNTP,合成出两条与亲代DNA分子完全相同的子代DNA分子的过程。

3.1DNA复制的基本机理

DNA由两条螺旋的多核苷酸链组成，两条链的碱基通过A:T和G:C之间的氢键联结在一起。在复制过程中首先两条链间的氢键破裂并使双链解旋和分开，然后以每条链为模板，按碱基互补配对原则(A:T，G:C)，由DNA聚合酶催化合成新的互补链，结果由一条链成为互补的两条链，这样新形成的两个DNA分子与原来的DNA分子的碱基序列完全相同。在此过程中，每个子代DNA的一条链来自亲代DNA，另一条链则是新合成的。这种复制方式称为半保留复制(semiconservativereplication)。

1958年Meselson和Stahl的实验首次有力地支持了半保留复制方式。他们先将大肠杆菌放在15NH4C1培养基中生长15代，使几乎所有的DNA都被15N标记后，再将细菌移到只含有14NH4C1的培养基中培养。随后，在不同的时间取出样品，用十二烷硫酸钠(SDS)裂解细胞后，将裂解液放在CsC1溶液中进行密度梯度离心(140000g，20小时)。离心结束后，从管底到管口，溶液密度分布从高到低形成密度梯度。DNA分子就停留在与其相当的CsC12密度处，在紫外光下可以看到形成的区带。14N-DNA分子密度较轻(1.7g/cm3)，停留在离管口这较近的位置;15N-DNA密度较大停留在较低的位置上。

当含有15N-DNA的细胞在14NH4C1培养液中培养一代后，只有一条区带介于14N-DNA与15N-DNA之间，这时在15N-DNA区已没有吸收带，说明这时的DNA一条链来自15N-DNA，另一条链为新合成的含有14N的新链。培养两代后则在14N-DNA区又出现一条带。在14NH4C1中培养的时间愈久，14N-DNA区带愈强，而14N-15NDNA区带逐渐减弱，但始终未出现其他新的区带。按照半保留复制方式培养两代，只能出现14N-15NDNA两种分子，而且随着代数的增加14N-DNA逐渐增加。Meselson和Stahl的实验完全证实了保留复制的设想。

Meselson等证明DNA的半保留复制

中国科学院上海生化与细胞所2002年招收硕士研究生分子遗传学入学考试：请设计一个实验来证明DNA复制是以半保留方式进行的（8分）。复制起点和复制子

DNA复制在生物细胞中要从DNA分子上特定位置开始。这个特定的位置就称为复制起点(Originofreplication)，用ori表示。DNA复制从起点开始双向进行直到终点为止，每一个这样的DNA单位称为复制子或复制单元(replicon)。

在原核生物中，每个DNA分子上通常只有一个复制子而在真核生物中，每个DNA分子有许多个复制子(多复制起点），每个复制子长约50-200kb。因此，真核细胞DNA的复制是由许多个复制子共同完成的

DNA复制不是随机的从DNA分子上的任何一点起始，而是从特定的区域开始，这说明复制起点有其结构上的特殊性。如科学家们利用分子克隆技术，分离出大肠杆菌染色体DNA复制起点oriC，发现其含有3个13bp的串联重复保守序列和4个9bp的保守序列。

DNA复制的特点

DNA复制的最主要特点是半保留复制另外，它还是半不连续复制(semi-discontinuousreplication)。

半不连续复制DNA双螺旋的两条链是反向平行的，因此，在复制起点处两条DNA链解开成单链时，一条是5'→3'方向，另一条是3'→5'方向。以这两条链为模板时，新生链延伸方向一条为3'→5'，另一条为5'→3'。但生物细胞内所有DNA聚合酶都只能催化5'→3'延伸，这是一个矛盾。冈崎片段(Okazakifragments)的发现使这个矛盾得以解决。

在复制起点两条链解开形成复制泡(replicationbubbles)，DNA向两侧复制形成两个复制叉(replicationforks)。以复制叉移动的方向为基准，一条模板链是3'→5'，以此为模板而进行的新生DNA链的合成沿5'→3'方向连续进行，这条链称为前导链(leadingstrand)。另一条模板链的方向为5'→'3'，以此为模板的DNA合成也是沿5'→3'方向进行，但与复制叉前进的方向相反，而且是分段，不连续合成的，这条链称为滞后链(laggingstrand)，合成的片段即为冈崎片段。这些冈崎片段以后由DNA连接酶连成完整的DNA链。这种前导链的连续复制和滞后链的不连续复制在生物是普遍存在的，称为DNA合成的半不连续复制。

AtleastonestrandofDNAreplicationinOkazakifragment1kbDNAreplicationinOkazakifragment1kb5‘3‘5‘3‘（semi-discontinuousreplication!）Okazakifragment1968ReijiOkazaki

复制的多模式

单起点、单方向多起点、单方向单起点、双方向多起点、双方向3.2DNA复制的过程DNA复制过程大致可以分为复制的引发，DNA链的延伸和DNA复制的终止三个阶段。(一)DNA复制的引发

复制的引发(Priming)阶段包括DNA复制起点双链解开，通过转录激活步骤合成RNA分子（RNA引物的合成），DNA聚合酶将第一个脱氧核苷酸加到引物RNA的3‘-OH末端。复制引发的关键步骤就是前导链DNA的合成，一旦前导链DNA的聚合作用开始，滞后链上的DNA合成也随着开始，在所有前导链开始聚合之前有一必需的步骤就是由RNA聚合酶(不是引物酶)沿滞后链模板转录一短的RNA分子。

在有些DNA复制中，(如质粒ColE)，该RNA分子经过加工成为DNA复制的引物。但是，在大部分DNA复制中，该RNA分子没有引物作用。它的作用似乎只是分开两条DNA链，暴露出某些特定序列以便引发体与之结合，在前导链模板DNA上开始合成RNA引物，这个过程称为转录激活(transcriptionalactivation)，在前导链的复制引发过程中还需要其他一些蛋白质，如大肠杆菌的dnaA蛋白。

这种蛋白质（dnaA蛋白）可以和复制起点处DNA上高度保守的4个9bp长的序列结合，其具体功能尚不清楚。可能是这些蛋白质与DNA复制起点结合后能促进DNA聚合酶Ⅲ复合体的七种蛋白质在复制起点处装配成有功能的全酶。

DNA复制开始时，DNA螺旋酶首先在复制起点处将双链DNA解开，通过转录激活合成的RNA分子也起分离两条DNA链的作用，然后单链DNA结合蛋白（SSBP)结合在被解开的链上。

由复制因子X(n蛋白)，复制因子Y(n'蛋白)，n"蛋白，i蛋白，dnaB蛋白和dnaC蛋白等6种蛋白质组成的引发前体(preprimosome)，在单链DNA结合蛋白的作用下与单链DNA结合生成中间物，这是一种前引发过程。

引发前体进一步与引物酶(primase)或引发酶组装成引发体(primosome)。引发体可以在单链DNA上移动，在dnaB亚基的作用下识别DNA复制起点位置。首先在前导链上由引物酶催化合成一段RNA引物，然后，引发体在滞后链上沿5'→3'方向不停的移动(这是一种相对移动，也可能是滞后链模板在移动，)，在一定距离上反复合成RNA引物供DNA聚合酶Ⅲ合成冈崎片段使用，引发体中许多蛋白因子的功能尚不清楚。

但是，这些成份必须协同工作才能使引发体在滞后链上移动，识别合适的引物合成位置，并将核苷酸在引发位置上聚合成RNA引物。

由于引发体在滞后链模板上的移动方向与其合成引物的方向相反，所以在滞后链上所合成的RNA引物非常短，一般只有3-5个核苷酸长。而且，在同一种生物体细胞中这些引物都具有相似的序列，表明引物酶要在DNA滞后链模板上比较特定的位置(序列)上才能合成RNA引物。

为什么需要有RNA引物来引发DNA复制呢?这可能尽量减少DNA复制起始处的突变有关。DNA复制开始处的几个核苷酸最容易出现差错，因此，用RNA引物即使出现差错最后也要被DNA聚合酶Ⅰ切除，提高了DNA复制的准确性。RNA引物形成后，由DNA聚合酶Ⅲ催化将第一个脱氧核苷酸按碱基互补原则加在RNA引物3'-OH端而进入DNA链的延伸阶段。

(二)DNA链的延伸

DNA新生链的合成由DNA聚合酶Ⅲ所催化，然而，DNA必须由螺旋酶在复制叉处边移动边解开双链。这样就产生了一种拓扑学上的问题:由于DNA的解链，在DNA双链区势必产生正超螺旋，在环状DNA中更为明显，当达到一定程度后就会造成复制叉难再继续前进，从而终止DNA复制。

但是，在细胞内DNA复制不会因出现拓扑学问题而停止。有两种机制可以防止这种现象发生:(1)DNA在生物细胞中本身就是超螺旋，当DNA解链而产生正超螺旋时，可以被原来存在的负超螺旋所中和;(2)DNA拓扑异构酶Ⅰ要以打开一条链，使正超螺旋状态转变成松弛状态，而DNA拓扑异构酶Ⅱ(旋转酶)可以在DNA解链前方不停地继续将负超螺旋引入双链DNA。

这两种机制保证了无论是环状DNA还是开环DNA的复制顺利的解链，再由DNA聚合酶Ⅲ合成新的DNA链。

DNA生长链的延伸主要由DNA聚合酶Ⅲ催化，该酶是由7种蛋白质(多肽)组成的聚合体，称为全酶。全酶中所有亚基对完成DNA复制都是必需的。α亚基具有聚合功能和5'→3'外切酶活性，ε亚基具有3'→5'外切酶活性。另外，全酶中还有ATP分子,它是DNA聚合酶Ⅲ催化第一个脱氧核糖核苷酸连接在RNA引物上所必需的，其他亚基的功能尚不清楚。

在DNA复制叉处要能由两套DNA聚合酶Ⅲ在同一时间分别进行DNA前导链和滞后链复制。如果滞后链模板环绕DNA聚合酶Ⅲ全酶，并通过DNA聚合酶Ⅲ，然后再折向与未解链的双链DNA在同一方向上，则滞后链的合成可以和前导链的合成在同一方向上进行。

这样，当DNA聚合酶Ⅲ沿着滞后链模板移动时，由特异的引物酶催化合成的RNA引物即可以由DNA聚合酶Ⅲ所延伸。当合成的DNA链到达前一次合成的冈崎片段的位置时，滞后链模板及刚合成的冈崎片断便从DNA聚合酶Ⅲ上释放出来。

这时，由于复制叉继续向前运动，便产生了又一段单链的滞后链模板，它重新环绕DNA聚合酶Ⅲ全酶，并通过DNA聚合酶Ⅲ开始合成新的滞后链冈崎片段。通过这样的机制，前导链的合成不会超过滞后链太多(最后只有一个冈崎片段的长度)。而且，这样引发体在DNA链上和DNA聚合酶Ⅲ以同一速度移动。

按上述DNA复制的机制，在复制叉附近，形成了以两套DNA聚合酶Ⅲ全酶分子、引发体和螺旋构成的类似核糖体大小的复合体，称为DNA复制体(复制体replisome

：复制叉上DNA模板以特定的结构与酶和蛋白质偶联成的核蛋白复合物)。复制体在DNA前导链模板和滞后链模板上移动时便合成了连续的DNA前导链和由许多冈崎片段组成的滞后链。

在DNA合成延伸过程中主要是DNA聚合酶Ⅲ的作用。当冈崎片段形成后，DNA聚合酶Ⅰ通过其5'→3'外切酶活性切除冈崎片段上的RNA引物，同时，利用后一个冈崎片段作为引物由5'→3'合成DNA。最后两个冈崎片段由DNA连接酶将其接起来，形成完整的DNA滞后链。(三)DNA复制的终止

过去认为，DNA一旦复制开始，就会将该DNA分子全部复制完毕，才终止其DNA复制。但最近的实验表明，在DNA上也存在着复制终止位点，DNA复制将在复制终止位点处终止，并不一定等全部DNA合成完毕。

目前对复制终止位点的结构和功能了解甚少,在DNA复制终止阶段令人困惑的一个问题是，线性DNA分子两端是如何完成其复制的?

已知DNA复制都要有RNA引物参与。当RNA引物被切除后，中间所遗留的间隙由DNA聚合Ⅰ所填充。但是，在线性分子的两端以5'→3'为模板的滞后链的合成，其末端的RNA引物被切除后是无法被DNA聚合酶所填充的。

在研究T7DNA复制时，这个问题部分地得到了解决。T7DNA两端的DNA序列区有160bp长的序列完全相同。而且，在T7DNA复制时，产生的子代DNA分子不是一个单位T7DNA长度，而是许多单位长度的T7DNA首尾连接在一起。T7DNA两个子代DNA分子都会有一个3'端单链尾巴，两个子代DNA的3'端尾巴以互补结合形成两个单位T7DNA的线性连接。然后由DNA聚合酶Ⅰ填充和DNA连接酶连接后，继续复制便形成四个单位长度的T7DNA分子。这样复制下去，便可形成多个单位长度的T7DNA分子。这样的T7DNA分子可以被特异的内切酶切开，用DNA聚合酶填充与亲代DNA完全一样的双链T7DNA分子。

在研究痘病毒复制时，发现了线性DNA分子完成末端复制的第二种方式。痘病毒DNA在两端都形成发夹环状结构。DNA复制时，在线性分子中间的一个复制起点开始，双向进行，将发夹环状结构变成双链环状DNA。然后，在发夹的中央将不同DNA链切开，使DNA分子变性，双链分开。这样，在每个分子两端形成一个单链尾端要以自我互补，形成完整的发夹结构，与亲代DNA分子一样。

在真核生物染色体线性DNA分子复制时，尚不清楚末端的复制过程是怎样进行的。也可能像痘病毒那样形成发夹结构而进行复制。

但最近的实验表明，真核生物染色体末端DNA复制是由一种特殊的酶将一个新的末端DNA序列加在刚刚完成复制的DNA末端。这种机制首先在四膜虫中发现。该生物细胞的线性DNA分子末端有30-70拷贝的5'TTGGGG3'序列，该细胞中存在一种酶可以将TTGGGG序列加在事先已存在的单键DNA末端的TTGGGG序列上。这样有较长的末端单链DNA，可以被引物酶重新引发或其他的酶蛋白引发而合成RNA引物，并由DNA聚合酶将其变成双链DNA。这样就可以避免其DNA随着复制的不断进行而逐渐变短。

在环状DNA的复制的末端终止阶段则不存在上述问题。环状DNA复制到最后，由DNA拓扑异构酶Ⅱ切开双链DNA，将两个DNA分子分开成为两个完整的与亲代DNA分子一样的子代DNA。

3.3与复制有关的酶和蛋白质

3.3.1DNA复制的复杂性

①复制过程解链需要能量供应②如何维持单链过程③DNA复制要求高度真实④超螺旋的问题⑤不同生物复制机制不同⑥线性DNA复制过程如何解决最后一个引物是怎样切除的3.3.2原核生物DNA复制的酶学

3.3.2.1DNA聚合酶

3.3.2.2引物酶和RNA聚合酶

3.3.2.3解螺旋酶

3.3.2.4单链结合蛋白（SSBP）

3.3.2.5依赖于DNA的ATP酶

3.3.2.6DNA连接酶

3.3.2.7旋转酶

3.3.2.1DNA聚合酶以E.coliDNA聚合酶为例:（1）大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ(DNApolymeraseⅠ，DNApolⅠ)（2）大肠杆菌DNA聚合酶Ⅱ(DNApolⅡ)：（3）大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ(DNApolⅢ)：

性质聚合酶Ⅰ聚合酶Ⅱ聚合酶Ⅲ3'5'外切活性+++5'3'外切活性+--5'3'聚合活性+中+很低+很高新生链合成--+主要是对DNA损伤的修复；以及在DNA复制时切除RNA引物并填补其留下的空隙。修复紫外光引起的DNA损伤DNA复制的主要聚合酶，还具有3’-5‘外切酶的校对功能，提高DNA复制的保真性原核生物中的DNA聚合酶(大肠杆菌）

㈠DNA聚合酶Ⅰ

主要负责DNA损伤的