10种人造矿物纤维对人淋巴细胞dna链断裂作用的比较研究

10种人造矿物纤维对人淋巴细胞dna链断裂作用的比较研究

石棉是人类确定的致癌废物。作为目前最重要的人造石材纤维（pmf），它具有相同的纤维状结构，与石棉具有类似的有害生物学作用。但流行病学调查尚未发现MMMF与人类肿瘤有关。为了解常用的MMMF的遗传毒性,研究选用日本纤维状物质研究协会提供的10种标准人造矿物纤维(JFM纤维)及国际癌症防治联合会(UICC)提供的温石棉B,测定并比较了这些矿物纤维对细胞DNA损伤。1材料和方法1.1阳性对照及试剂人造矿物纤维JFM纤维由日本纤维状物质研究协会提供,其主要名称及特征见表1。阳性对照为UICC温石棉。试剂:淋巴细胞分离液(上海试剂二厂);TritonX-100(sigma);溴化乙锭(E.B)(sigma);正常熔点琼脂糖(NMPA),低熔点琼脂糖(LMPA)(GIBCO)。1.2方法1.2.1受试物的制备每次实验取健康成年人血液5ml,先用PBS稀释1倍,然后用淋巴细胞分离液分离(2000r/min×25min,1次),取淋巴细胞层离心(1000r/min×10min,1次),弃上清,用RPMI-1640细胞培养液配成106个/ml的淋巴细胞悬液,取1.5ml细胞悬液加100μl不同浓度的受试物,于24孔细胞培养板中,37℃5%CO2恒温培养1h。1.2.2scge程序描述如下1.2.2.含细胞的“麻黄”凝胶的制备于磨砂玻片上滴加1.0%NMPA0.5ml,室温下待凝固后,刮去NMPA,接着铺上第一层0.6%NMPA70μl,并立即盖上玻片,置室温下10min,使胶凝固,取10μl细胞反应悬液与80μl0.6%LMPA混匀,在37℃下混合,滴加70μl于第一层凝胶上,成第二层凝胶,再滴加80μl0.6%LMPA,成第三层凝胶,即制成含细胞的“三明治”凝胶。铺第二层、第三层凝胶时需置于4℃下5~10min,待凝固后再铺下一层凝胶。1.2.2.t保电泳检测将载玻片浸入新鲜配置的裂解液(2.5mol/LNaCl,100mmol/LEDTA,10mmol/LTris,10%DMSO和1%TritonX-100,pH10),4℃裂解1h,再置入新鲜配制的电泳液(300mmol/LNaOH,1mmol/LEDTA,pH13),静置20min,使DNA双链充分松解,调节电泳电压为25V,电流为300mA,电泳30min。1.2.2.中和液染色。采用溴化乙锭染色用预冷的0.4mmol/LTris缓冲液(pH7.4)中和3次,然后滴加2μg/ml溴化乙锭100μl染色,盖上盖玻片,4℃避光放在潮湿条件下保存,2d内阅片。1.2.2.迁移率及迁移度在荧光显微镜下,每片随机观察100个细胞。观察指标选用迁移率和迁移度。迁移率=(拖尾细胞数/检查细胞数)×100%;迁移度=(Σ每个细胞直径长度/n)±s,统计方法用χ2检验和t检验。2结果2.1人细胞dna链的断裂由表2可见10种JFM纤维和温石棉、石英均可明显引起人淋巴细胞的DNA链的断裂。其中耐火纤维RF1、RF2、RF3、石英的作用与温石棉相似,其它JFM纤维则明显低于温石棉。2.21遗传毒性评价将10种JFM纤维、石英与温石棉用反映JFM纤维对细胞群体致DNA链断裂效应的迁移率和以JFM纤维的致断裂强度的迁移度2个指标的影响程度综合评价,由高到低进行排序,并将其序号相加,10种JFM纤维,石英和温石棉的遗传毒性由大至小依次为:温石棉、石英、RF1、RF2、MG1、SC1、RF3、TO1、RW1、WO1、PT1、GW1。3jfm纤维的致病性本研究结果表明,10种JFM纤维及石英均可不同程度地引起DNA链断裂,但损伤程度均低于温石棉的作用。从反映JFM纤维致断裂效应在细胞群体中的发生率的迁移率和以反映JFM纤维的致断裂强度的迁移度的综合评价:耐火纤维RF1、RF2、MG1,石英与温石棉引起的DNA链断裂程度接近,RF3、SC1、TO1略弱,统计学上与对照组比较都有显著性差异,其它JFM纤维均低于温石棉。10种JFM纤维的遗传毒性各不相同,有的相差很多,但均明显低于温石棉。根据改进的Stanton假设,矿物纤维的致病性,不仅随纤维的尺寸变化而变化,也与纤维的类型包括化学构成、晶体结构、表面物理化学特性有关。本研究所采用的10种JFM纤维及温石棉的尺寸及纤维类型各不相同,且采用了重量浓度。由于单位重量所含的纤维数目不同,因此表现出其效应有差异。如本研究中微细玻璃棉(MG1)与玻璃棉(GW1)同是玻璃纤维,长度和直径相差6.7倍和3.7倍,故引起DNA断裂效应就明显不同,MG1与对照比较有显著性差异,GW1没差异。此外本实验是体外实验,MMMF对体内细胞和整体动物呼吸及肺方面的致病性未考虑进去,不能完全说明JFM纤维的遗传毒性。虽然近年来许多动物实验未发现MMMF能引起动物肺部肿瘤,人群流行病学调查也缺乏MMMF致癌的阳性资料,但本研究的结果表明JFM纤维在体外实验中的确存在不同程度的遗传毒性,虽然低于温石棉,但MMMF近年来应用甚广,有必要对其致癌性做进一步的深入研究。目前国内外学者在分析SCGE试验数据时,多采用依据DNA“慧星细胞”尾部的量对DNA损伤程度分级或荧光强度作为观察评价指标。由于难以掌握标准,给评价带来一些困难。本研究用迁移率来反映JFM纤维的致断裂效应在细胞群体中的发生率,用以评价该纤维引起的剂量反应关系,同时用迁移度来反映待测JFM纤维的致断裂强度用以评价纤维