蜘蛛香总黄酮对h22小鼠抗肿瘤作用及对cancil的影响

蜘蛛香总黄酮对h22小鼠抗肿瘤作用及对cancil的影响

肝癌是世界上最常见的肿瘤之一，其恶性程度高，发展迅速，预后差，严重威胁着人们的健康和生活。蜘蛛香总黄酮系败酱科(Valerianaceae)缬草属(ValerianaLinn.)植物蜘蛛香(ValerianajatamansiJones)的根茎和根,课题组前期研究发现,蜘蛛香总黄酮提取物对体外培养的人结肠癌细胞具有明显的抑制增殖和抗转移作用。本研究通过建立荷H22小鼠模型,进一步考察了其体内抗肝癌作用,应用小鼠全基因组基因芯片对pathwaysincancer的变化进行了考察,从而在信号通路水平研究其抗肿瘤作用机制。1材料表面1.1动物1.2肿瘤植株小鼠肝癌H22瘤株,由四川大学华西医学中心免疫实验室提供。2方法2.1动物模型的制备2.2dna的纯化、纯化及分析。式中,C为模型组平均瘤重(g),T为给药组平均瘤重(g)。②基因表达谱芯片检测:股动脉取血后处死小鼠,解剖取出肿瘤,迅速放入液氮罐冻存。采用Trizol(Invitrogen公司)一步法提取小鼠肿瘤的总RNA,RNeasyminikit(Qiagen公司)纯化RNA,用琼脂糖凝胶电泳对样品总RNA进行定量、质检。实验标记方法采用Agilent放大标记方法,各取适量探针进行杂交,杂交方法采用65℃,17h滚动杂交,并在室温洗片。芯片结果采用Agilent扫描仪进行扫描(Scanresolution:5μm;PMT:100%,10%),AgilentFeatureExtraction软件读取数据。最后采用FeatureExtraction进行Normalize处理分析。通过AgilentGeneSpringGXsoftware软件处理得到基因表达变化的倍数。差异表达基因筛选标准为比值>2为表达上调基因,比值<0.5为表达下调基因(数据小于0.5时取倒数)。通过KEGG信号通路数据库,查询各用药组与模型对照组相比表达差异基因所参与的pathwaysincancer变化情况。3结果3.1肝癌抑制作用3.2各组遗传因素的差异3.3各组遗传因素的差异3.4遗传因素的差异是对遗传因素的分析4tfr、igf1和pi3k-akt1的结构及表达我们在前期体内抗H22活性的基础上,运用基因表达谱芯片技术对蜘蛛香总黄酮抑制小鼠H22的差异表达基因进行初步筛选,以期从基因水平阐释出蜘蛛香总黄酮抗H22肝癌的机制。通过对差异表达基因的分析,发现下调的基因在pathwaysincancer通路中都起到对肿瘤促进作用,参与血管生成、抑制肿瘤细胞凋亡、促进肿瘤细胞增殖和迁移等多个方面。研究发现Epas1、Pdgfra均能通过诱导Vegf的表达促进血管的生成,下调Epas1、Pdgfra、Vegfc、Figf能抑制血管生成,从而阻止肿瘤细胞的生长和转移。Csf1r的过量表达与肝癌细胞的生长、分化及转化密切相关,可能是c-fms原癌基因发生点突变导致Csf1r表达量增加,后者通过自分泌生长方式促进肝癌细胞的生长和转化。同时,Pdgfra、Vegfc、Figf、Csf1r、Igf1又能通过PI3K-AKT途径促进肿瘤生成、侵袭和转移。Pik3r1是一类特异的催化磷脂酰肌醇脂物质的激酶,由其活化而产生的类脂产物PIP2和PIP3作为第二信使结合并激活多种细胞内靶蛋白,形成一个信号级联复合物,最终调节细胞的增殖、分化、存活和迁移,通过下调Pdgfra、Vegfc、Figf、Csf1r、Igf1、Pik3r1、Prkcb而抑制了PI3K-AKT途径。Fzd9Frizzle基因家族的成员编码了一个7次跨细胞膜的跨膜蛋白,这个蛋白是Wnt信号通路的组成成员,并在其中发挥了重要的作用。Wnt途径的异常活化在细胞癌变、肿瘤发生及肿瘤侵袭过程中具有重要的作用。当基因本身或通路其他任一成员因素发生变化使其不正常活化时,均有可能引起肿瘤,其中FZD受体的异常表达可见于多种恶性肿瘤。Tcf7l1、Tcf7l2、Fzd9、Prkcb参与Wnt信号传导通路,与肿瘤细胞增殖和分化相关。下调这些基因,能从Wnt途径对肿瘤起到抑制作用。CyclinE是细胞周期蛋白中的一种,它可与CDk2结合形成复合物,磷酸化其底物,释放转录因了E2F,启动DNA复制,使细胞由G1期进入S期,是G1/S期转换的主要限速因子,P15(CDKN2B)在TGFβ介导的生长抑制中起重要作用。TGFβ诱导细胞阻滞在G1期,起源于P15转录量的增加,后者可与cyclinD/cdk4、cyclinD/cdk6复合体结合,取代复合体中的P27,使P27结合并抑制cyclinE/cdk2复合体。TGFβ抑制生长的作用归因与上述两种cyclin/cdk复合体的共同抑制。Myc基因是人类肿瘤中最常见的高表达的癌基因之一,它在肝癌中呈高表达,涉及肿瘤发生发展过程中许多方面,如细胞增殖、分化、凋亡等。各种模式证实,c-myc的过度表达能导致细胞增殖和细胞死亡都增加,从而使肿瘤的绝对细胞数没有净增加。同时,我们发现Ctbp2、Mmp1a、Vegfa出现了上调,这3个基因分别涉及促进上皮-间质转化、降解多种细胞外基质和基底膜成分和促血管生成,这说明蜘蛛香总黄酮抑制肿瘤作用的复杂性有待于我们的下一步深入探讨。总之,蜘蛛香总黄酮可以通过下调多种功能基因从肿瘤细胞凋亡、增殖和迁移等多个方面发挥抗肿瘤作用。其抗肿瘤作用是多个靶基因共同作用的结果,尚需使用功能分类基因芯片对表达谱芯片进行进一步研究。昆明种小鼠,体重18~22g,雌雄各半,由成都达硕生物科技有限公司提供,合格证号:SCXK(川)2008-24。1.3齐鲁制药有限公司蜘蛛香,购于成都市荷花池药材市场;替加氟,齐鲁制药有限公司,批号910006LD;羧甲基纤维素钠(CMC-Na),成都市科龙化工试剂厂,批号20090929。1.4仪器与检测方法Agilent小鼠全基因4*44K芯片,美国Roche-Nimblegen公司;PTC-100PCR仪,美国MJ公司;G2545A杂交炉,美国Agilent公司;G2565BA扫描仪,美国Agilent公司;ND1000分光光度计,美国Nanodrop公司。无菌操作条件下取荷肝癌H22小鼠腹水,生理盐水稀释至肿瘤细胞浓度为1×107·mL-1,于每只小鼠左腋皮下接种0.2mL。蜘蛛香总黄酮:采用超声提取法从蜘蛛香干燥粉末中提取,并用HPD600大孔树脂进行纯化,得到的总黄酮质量分数为41.20%。将上述制得的蜘蛛香总黄酮用0.5%CMC-Na分别配成高、低两个剂量,密封,置4℃冰箱中冷藏备用。替加氟溶液:用0.5%CMC-Na将替加氟片配成浓度10mg·mL-1的溶液,密封,置4℃冰箱中冷藏备用。2.3mt-na的制备接种第二天,将小鼠称重并随机分为4组,每组10只,雌雄各半。模型对照组:灌胃0.5%CMC-Na,20mL·kg-1;阳性对照组:灌胃替加氟溶液,200mg·kg-1;蜘蛛香总黄酮高、低剂量组:灌胃蜘蛛香总黄酮提取物溶液,剂量分别为生药450mg·kg-1、150mg·kg-1。每日按0.2mL·10g-1标准定时灌胃给药1次,连续给药10d。2.4两组患者施工前后ph、nb、csf1和vegf1的基因表达比较①瘤重和抑瘤率:给药结束次日,将动物股动脉取血后处死,小心剥离出皮下肿瘤块并称重,按下式计算出肿瘤抑制百分率。阳性对照组、蜘蛛香总黄酮高、低剂量组的平均瘤重明显降低,与模型对照组相比具有统计学意义(P<0.01或P<0.05),各组的抑瘤率分别为45.32%、30.06%、25.97%,见表1。运用KEGG信号通路数据库,查询各用药组与模型对照组相比表达差异基因所参与的pathwaysincancer变化情况,发现阳性对照组、蜘蛛香总黄酮高剂量组和低剂量组与模型对照组相比,pathwaysincancer中17个基因的表达同时发生了显著性变化,其中6个明显上调,11个明显下调,见表2。相对于模型对照组,阳性对照组、