药用植物蜘蛛香总草素提取纯化工艺研究

药用植物蜘蛛香总草素提取纯化工艺研究

云南省、四川省和贵州省主要从事虚假药物综合征。具有镇静安神、抗抑郁、抗菌消炎等功效。镇静安神的主要活性成分是甘草素，含量高于其他植物，是制备甾醇的主要原材料。大孔树脂因其分离性能优良、性质稳定、方便经济等诸多优点,广泛应用于植物成分的提取分离。本实验采用正交试验法筛选蜘蛛香总缬草素提取方法,并考察几种常用大孔树脂的吸附性能及适宜树脂的工艺参数,得到最佳富集分离工艺,为充分利用蜘蛛香及后续研究奠定基础。1仪器和试剂盒1.1色谱分析和紫外分析HP1100型高效液相色谱仪(安捷伦,含四元泵及二极管阵列检测器);色谱分析柱(美国Phenomenex公司,Luna5μmC18(2)100A,250mm×4.6mm);WFH-203B三用紫外分析仪(上海精科实业有限公司);SAS8.0统计分析软件。1.2c、乙腈、b、c药材样品购自云南昆明,经鉴定为败酱科植物蜘蛛香ValerianawallichiiDC的干燥根及根茎;缬草素标准品(自制);AB-8、D4006、X5、D101、D4020型大孔吸附树脂(天津南开化工厂);乙腈(色谱纯,美国Fisher公司);纯净水(杭州娃哈哈集团,经0.45μm水系滤膜滤过);石油醚、乙酸乙酯均为分析纯。2方法和结果2.13草素提取技术的研究2.1.1材料预处理蜘蛛香药材冷冻粉碎,分别过40目、80目、120目筛,每种粒度取三份,每份20g。2.1.2提取工艺的优选预试验得知提取总缬草素的主要影响因素为加醇量、浸泡时间、药材粒度及渗漉次数。对以上每个因素设计三个水平,采用L9(34)正交试验表,HPLC法测定缬草素含量为指标,对总缬草素提取工艺进行优选。因素水平见表1,正交试验结果见表2,SAS8.0方差分析结果见表3、表4。统计结果显示:A因素和B因素差异极显著(P<0.01),D因素差异显著(P<0.05),C因素(粉碎粒度)差异不显著,影响程度为A>B>D>C。由于C因素K1、K2相差不大,确定最佳提取工艺为A3B1C1D2,即蜘蛛香冷冻粉碎,过40目筛,10倍量95%乙醇浸泡0.5h,渗漉提取3次。2.2总草素提取技术的研究2.2.1水、3倍树脂体积65%乙醇、蒸馏多次冲洗树脂蒸馏水湿法装柱,依次用蒸馏水、3倍树脂体积95%乙醇、蒸馏水多次冲洗,再用5倍树脂体积95%乙醇冲洗,最后蒸馏水洗至无醇味。2.2.2树脂吸附能力测定缬草素类成分极性较小,故选取5种非极性或弱极性树脂进行平行操作。分别精密称取缬草素200mg,树脂体积20ml,95%乙醇50ml溶解上样后测定吸附量;95%乙醇200ml洗脱,洗脱液蒸干称重,计算树脂洗脱率。结果显示AB-8型树脂在各项指标中均为最高,确定选用该树脂,详见表5。2.2.3追踪泄漏点树脂体积50ml,1mg/ml缬草素水溶液500ml上样,记录上样体积,流出液每5ml收集一次,TLC追踪泄漏点。结果可见树脂最大吸附量为6.6mg/ml(流出液体积330ml),吸附曲线见图1。2.2.4原液ph值对ab-8大孔树脂吸附效果缬草素类成分属环烯醚萜类,在酸、碱环境下易发生羟醛缩合生成半缩醛羟基,使结构发生变化。故上样液应保持中性。2.2.5标准溶液用量。采用草素法上样,将样品主要加入水净水、5.装等规格50ml树脂柱6根,精密称取氯化钠0mg、75mg、175mg、325mg、475mg、625mg溶于水中,每份加入缬草素0.15g,定容至50ml分别上样。结果确定适宜盐离子浓度为3.5mg/ml,详见表6。2.2.6乙醇溶液上样装等规格50ml树脂柱6根,分别以浓度为1mg/ml、4mg/ml、8mg/ml、10mg/ml、14mg/ml、18mg/ml的缬草素乙醇溶液各20ml上样。结果确定原液适宜浓度为10mg/ml,详见图2。2.2.7乙醇溶解上样装等规格50ml树脂柱4根,精密称取缬草素1.3g,适量乙醇溶解定容于100ml,分别以流速2BV/h(柱体积/小时)、3BV/h、4BV/h、5BV/h各上样20ml。结果确定适宜吸附流速为3BV/h,详见表7。2.2.8水及不同浓度乙醇洗脱效果tlc装等规格50ml树脂柱10根,精密称取总缬草素干膏0.5g,用95%乙醇溶解过滤后定容至200ml,各取20ml上样;分别以水、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇各100ml洗脱,TLC比较水及不同浓度乙醇的洗脱效果。结果表明乙醇浓度为60%时始检出缬草素成分,计算60%、70%、80%、90%乙醇的洗脱量和洗脱率,可见缬草素在乙醇浓度为70%时洗脱量相对较大,为适宜洗脱溶剂,详见表8。2.2.9流速洗脱装等规格50ml树脂柱4根,精密称取缬草素1g,用95%乙醇溶解定容至80ml,各取20ml上样;70%乙醇分别以流速1BV/h、2BV/h、3BV/h、4BV/h洗脱250ml。结果确定适宜吸附流速为2BV/h,详见表9。2.2.1洗脱液解吸浓度的测定精密称取一定量缬草素,70%乙醇洗脱,洗脱液每0.5BV收集一份,以解吸液体积(BV)为横坐标,解吸浓度(mg/ml)为纵坐标绘制解吸曲线。结果表明,洗脱液洗脱至4倍树脂体积后,缬草素可认为解吸完全。解吸曲线见图3。由以上实验优选出AB-8型树脂的纯化工艺为:蜘蛛香粗提物95%乙醇适量溶解,盐离子浓度3.5mg/ml中性上样,吸附流速3BV/h,70%乙醇流速2BV/h洗脱至4倍柱体积,35℃回收溶剂得总缬草素。2.3总草素的提取蜘蛛香根及根茎200g,冷冻粉碎,过40目筛,加95%乙醇10倍量浸泡0.5h,渗漉提取3次,30℃减压回收溶剂,依上述AB-8型树脂优选纯化工艺得总缬草素。此流程进行3次平行试验,采用HPLC检测缬草素含量。3次实验含量RSD值为1.12%,详见表10。3树脂纯化和重复合成法分离提取药材3.1缬草素类成分属环烯醚萜类,对热不稳定,故提取纯化温度不宜过高(<37℃)。本实验确定药材粗粉过40目筛、采