第五章 酶化学

第五章酶化学

(EnzymeChemistry)1.了解酶的命名和分类2.弄清酶的化学本质3.掌握理解酶活性中心、酶活性、反应初速度、比活性、Km、最适PH、最适温度、酶原、竞争性抑制4.掌握酶促反应机制5.掌握酶促反应的影响因素6.了解同功酶、诱导酶、别构酶、固定化酶的本质和应用５.１酶是生物催化剂

一、酶的概念

酶是生物活细胞产生的，以蛋白质为主要成分的生物催化剂。1878年,

Kuhle开始使用Enzyme这一术语。

酶虽然是细胞产生，但并非必须在细胞内才能起作用。有些酶被分泌到细胞外才发生作用，这类酶被称为“胞外酶”；大部分酶在细胞内起催化作用，这类酶被称为“胞内酶”。

酶在生物体内具有非常重要的生理意义：

二、酶的化学本质1.酶是蛋白质1926年，Sumer第一次从刀豆种子中提取了脲酶(Urease)结晶，证明其具有蛋白质性质

20世纪30年代Northrop又分离出结晶的胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶，证明酶的化学本质是蛋白质。（1）酶具有蛋白质的特性：两性解离、胶体性质、加热变性、颜色反应等；（2）酶可被蛋白酶水解而丧失活性；（3）许多酶的氨基酸顺序已被测定；（4）1969年，人工合成牛胰核糖核酸酶2.Rhbozyme的化学本质是RNA核酶（Rhbozyme）是指具有催化活性的RNA。作用对象主要是RNA。在已鉴定的数千种酶中，绝大多数酶的化学本质是蛋白质，但1982年美国科学家T.Cech发现原生动物四膜虫的26srRNA前体具有自我拼接的催化活性,T.Cech将这种RNA命名为Rhbozyme。剪切型核酶剪接型核酶根据催化反应锤头核酶I内含子II内含子发夹核酶丁型肝炎病毒（HDV)核酶RNaseP核酶的分类核酶的催化性质核酸酶催化的反应主要包括:水解反应(RNA限制性内切酶活性)，连接反应(聚合酶活性)和转核苷酰反应等。作用底物除RNA外，最近发现还有多糖、DNA以及氨基酸酯等。核酶的研究中的两个问题核酶催化效率太低由于核酶本身是RNA，很容易被核酸水解酶(RNase)所破坏因此，要将核酶应用于体内阻断基因表达或作为抗病毒的临床药物，还要做大量的研究工作。3.有些DNA也有催化活性

1995年Cuenoud等发现有些DNA分子亦具有催化活性。4．抗体酶（abzyme）抗体：与抗原特异结合的免疫球蛋白。抗体酶：指具有催化功能的抗体分子，在抗体分子的可变区（即肽链的N端）是识别抗原的活性区域，这部分区域被赋予了酶的属性。实质是具有催化活性免疫球蛋白。1986年美国Schultz和Lerner两个实验室同时在Science上发表论文，报道他们成功地得到了具有催化活性的抗体酶与抗体这两种蛋白质之间尽管功能不同，但它们与各自的配基(酶-底物、抗体-抗原)的结合特性，如结合方式、动力学过程等都非常相似。从20世纪60年代起，有人开始了对抗体进行修饰，并使其获得酶的属性的研究。即抗体酶是通过人工的方法使其获得了酶的属性，所以又称为催化性抗体(catalyticantibody)。（1）抗体酶的制备专一性催化某种碳酸酯和羧酸酯水解的抗体酶的制备方法主要包括以下几个过程：过渡态类似物(半抗原)的构建抗原的制备应用单克隆抗体筛选技术制备抗体酶酶与底物形成过渡态理论是基础

酶活性中心的活性基团与底物相互作用形成稳定的过渡状态，大大降低了反应的活化能。构建一个对某种过渡状态具有最佳缔合状态的抗体，就有可能观察到抗体催化相应底物发生化学反应的效果。过渡态类似物(半抗原)的构建由于准确的过渡状态很难确定或难以合成，因此，制备抗体酶时用的半抗原（haptens)是一个结构比较稳定、在价键取向、电荷分布等都与过渡态相似的类似物(transitionstateanalog)。抗原的制备将人工设计并构建的过渡态类似物(半抗原)，用化学方法经间隔基与载体蛋白相连，即形成一个抗原(antigen)。应用单克隆抗体筛选技术制备抗体酶人们无法从血清中得到单一的抗体动物脾脏中的淋巴细胞B(lymphocyteB)的细胞，它能产生并分泌出唯一的一种抗体。

1975年单克隆抗体（monoclonal

antibodies）技术发明单克隆抗体技术的关键是将分离纯化的骨髓瘤细胞（myelomacell）在培养条件下与淋巴细胞B融合生成一种特殊的杂交瘤细胞（hybridomacell）。这种杂交瘤细胞能够产生单一的抗体，又能在细胞培养条件下快速繁殖，因而可以大量制备单一抗体。（2）抗体酶的发展前景用于研究酶的作用机制在抗体酶研究过程中，可以直接观察到过渡态类似物对抗体酶设计所起的重要作用。用于实现酶促反应的有机合成三、酶的特性1．酶与一般无机催化剂比较所具有的共性（1）用量少而催化效率高：细胞内含量少；

（2）能加快化学反应的速度，但不改变平衡点，反应前后本身不发生数量和质量的变化；

（3）降低反应所需的活化能。活化能：在一定温度下，1mol底物全部进入活化状态所需要的自由能，单位J/mol例：2H2O2→2H2O+O2

反应 活化能非催化反应 75.24kJ/mol钯催化反应 48.9kJ/molH2O2酶催化 8.36kJ/mol（4）从热力学看，只能催化热力学上允许进行的反应2．酶作为生物催化剂的特性

（1）酶催化的高效性就分子比而言，以摩尔为单位进行比较，酶的催化效率比化学催化剂高107～1013倍，比非催化反应高108～1020倍。以转换数(turnovernumber,即每个酶分子每分钟催化底物转变的分子数)表示，大部分酶为1000左右，β-半乳糖苷酶为12500，β-淀粉酶为1100000，最高的是碳酸酐酶，达36000000。酶如何有如此惊人的催化能力呢?

例：2H2O2→2H2O+O2

1molH2O2酶能催化5×106molH2O2的分解1molFe3+只能催化6×10-4molH2O2的分解绝对专一性结构专一性基团专一性相对专一性键专一性专一性

旋光异构专一性

立体专一性

几何异构专一性（2）酶催化的专一性酶的专一性是指酶对底物及催化的反应的选择性。一种酶仅能作用于一种物质或一类结构相似的物质，促使其发生一定的化学反应。①绝对专一性：酶对底物要求非常严格，只作用于一种底物。如：脲酶：只催化尿素水解；琥珀酸脱氢酶只作用于琥珀酸。②相对专一性：对底物要求程度较低，能作用于结构相似的一类物质。包括基团专一性和键专一性。基团专一性要求底物具有一定的化学键，且对键一端连接的基团也有一定的要求。如：a-葡萄糖苷酶不仅要求a-糖苷键，还要求糖苷键的一端是葡萄糖。键专一性只要求作用于一定的化学键，对键两端的基团无严格要求。如：酯酶对O酯键都起作用

R-C-O-R

③立体异构专一性：只催化特定的立体异构体发生某种化学反应。包括旋光异构专一性和顺反异构专一性。旋光异构专一性：当底物具有旋光异构体时，酶只能作用于其中的一种。如：L-AA氧化酶只能催化L-AA的氧化，而对D-AA无作用。手性底物，如：淀粉酶只水解D－葡萄糖形成的1,4-糖苷键。顺反异构专一性：对具有顺式和反式异构的底物具有严格的选择性。如：延胡索酸水化酶只能作用于反-丁烯二酸+水生成苹果酸，而对顺-丁烯二酸则不发生作用。3.酶活性的可调控性己糖激酶G+ATP

G-6-P+ADP当生物体内G-6-P积累时，会抑制己糖激酶的活性，避免G和ATP的过分消耗。4.反应条件温和：例5.酶易失活(易变性)：凡使蛋白质变性的因素均能使酶破坏而失活6.常需辅助因子：酶的催化活力与辅酶、辅基和金属离子有关如酶浓度的调节、激素调节、反馈调节、抑制剂和激活剂的调节、别构调节、酶的共价修饰调节、酶原活化等。6CO2+6H2O+能量C6H12O6+6O2↑植物动物N2+3H22NH3某些微生物N2+3H2

500℃,300大气压Fe2NH3酶催化反应条件温和：5.2

酶的命名和分类（一）国际系统命名法：

能确切地表明底物的化学本质及酶的催化性质,包括三个部分:

底物名称+反应类型+词尾（-ase，酶）。乳酸:NAD+氧化还原酶。1.名称由两部分组成：底物＋反应类型如：ATP:己糖磷酸转移酶。G-6-P→F-6-PG-6-P异构酶2.不管酶催化正反应还是逆反应，都用同一名称。如：DH2:NAD氧化还原酶3.若有两种底物，在两个底物之间用:分开。其中一个底物为水时，水可略去。丙氨酸+α-酮戊二酸→谷氨酸+丙酮酸，丙氨酸:α-酮戊二酸氨基转移酶脂肪+H2O→脂酸+甘油，脂肪水解酶一、酶的命名(二)习惯名或常用名：1.根据酶所作用的底物命名如：淀粉酶，蛋白酶2.根据酶所催化的反应命名如：转氨酶，脱氢酶3.根据底物、反应相结合如：琥珀酸脱氢酶、谷丙转氨酶4.根据酶的来源：胰蛋白酶、木瓜蛋白酶二、酶的分类1.氧化还原酶类（oxido-reductases)：催化氧化还原反应的酶。琥珀酸脱氢酶，醇脱氢酶，多酚氧化酶AH2+BA+BH2脱氢酶AH2+O2A+H2O2

氧化酶2.转移酶类（transferases)：催化分子间基团转移的酶。转氨酶，己糖激酶AR+BA+BR(一）国际系统分类法：酶的六大类国际酶学委员会制定的“系统分类法”将酶分为六大类，在每一大类又分若干亚类。3.水解酶类（hydrolases)催化水解反应的酶。蛋白酶，淀粉酶，脂肪酶。AB+H2OAOH+BH4.裂合酶类（lyases)：催化非水解地除去底物分子中的基团及其逆反应的酶。醛缩酶，脱氨酶，脱羧酶。

ABA+B5.异构酶类（isomerases)：催化分子异构反应的酶。葡萄糖异构酶，甘油变位酶。

AB6.合成酶类（ligases)：与ATP（或相应的核苷三磷酸）的一个焦磷酸键断裂相偶联，催化两个分子合成一个分子的反应。谷氨酸合成酶，丙酮酸羧化酶

A+B+ATPAB+ADP+Pi（二）编号:用4个阿拉伯数字的编号表示，数字中用“·”隔开，前面冠以EC（为EnzymeCommission）。EC类.亚类.亚亚类.排号，如EC1.1.1.1EnzymeHandbook，ThomasEBarman编，VolI,VolII1969年。

EnzymeHandbook，ThomasE.Barman编SupplementI,1974年。如：SOD（超氧化物歧化酶）——EC1.15.1.1（EnzymeCommission）

发现于1969年，是广泛存在于生物体内的一种金属酶，生产用的原料可以是动物血（猪、羊、牛血）亦可是植物种子和叶，SOD是氧自由基专一清除剂，主要功能是“一清四抗”即清除体内多余的自由基，具有护肤美容的功效,“四抗”为抗肿瘤，抗疲劳，抗病及抗衰老。目前产品主要作为药用酶、保健食品，或作为化妆品的添加剂。

SOD:超氧化物歧化酶超氧阴离子自由基的产生：e+O2==O2

超氧阴离子自由基通过各种方式，损害机体，破坏细胞结构，攻击核酸和蛋白质。超氧阴离子自由基还能引起脂质过氧化，过氧脂质与蛋白质交联，产生不溶性蛋白质。这种变化以结缔组织中胶原蛋白最明显，它能导致胶原变粗，长度缩短，使皮肤失去膨胀力，即所谓皱纹。

超氧阴离子自由基与脂肪反应产生的过氧化脂质在氧化酶的作用下，能分解成丙二醛等并与邻脂酰乙醇胺之交联生成黄色色素，然后再与蛋白质、核酸等物质形成褐色物质，即所谓色斑。其褐色质不仅出现在面部，亦出现在体内其他部位。如心、脑、肝等。

在正常情况下，自由基由产生到清除，是处于平衡状态。

SOD2H2O+O2-

==2H2O2+O2过氧化氢酶2H2O2

==

2H2O+O2谷胱甘肽过氧化物酶2H2O2+2G-SH

==

2H2O+GSSG5.3酶的组成与结构酶的组成几个重要的酶辅因子酶的结构酶的活性中心一、酶的组成不同酶的化学组成成分不同：

1．单纯酶类：只由蛋白质组成。如脲酶、淀粉酶、蛋白酶2．结合酶类：除蛋白质外，还含有对热稳定的非蛋白质小分子物质——辅助因子。酶蛋白和辅助因子单独存在时均无活性，只有二者结合成完整的分子才具有活性。酶蛋白和辅助因子结合起来成为全酶。全酶=酶蛋白+辅助因子酶蛋白决定酶促反应的专一性和高效性，辅助因子作为电子、原子或基团的载体参与反应并促进反应。辅助因子包括辅酶、辅基或金属离子辅酶（coenzyme）：与酶蛋白结合疏松，用透析法可以除去辅基（prostheticgroup）：与酶蛋白结合紧密，不能用透析法可以除去辅酶和辅基往往是由维生素参与形成的小分子有机化合物。金属离子：与酶蛋白结合有的松，有的紧二、几个重要的酶辅因子1.辅酶、辅基：（1）TPP:噻唑环，羧化辅酶，与a-酮酸氧化脱羧有关

(2)FMN：异咯秦环，传递氢(3)COA：巯基，传递酰基（酰基载体）(4)NAD+

、NADP+：烟酰胺的吡啶环，传递氢（5）磷酸吡哆醛：传递氨基（氨基载体）（6）生物素：尿素环，传递二氧化碳（7）四氢叶酸：氮-5，氮-10，传递一碳基团（8）维生素C：2，3碳位上的烯醇式羟基，传递氢（9）硫辛酸：巯基，酰基和氢的载体2.金属离子：（1）活性中心的组成成分。如多酚氧化酶中的Cu(2)在酶和底物之间起作用，如羧肽酶中的Zn（3）稳定结构活性中心结合部位必需基团催化部位维持活性中心的必需基团酶分子

非必需基团1.必需基团：酶分子中有些经过化学修饰就会失活的基团。与酶的催化活性有关。包括活性中心基团和维持活性中心的基团。活性中心的必需基团：与底物结合非活性中心的必需基团：具有空间支撑或结构维持作用2.非必需基团：与酶的其它活性有关，如识别、定位、免疫等三、酶的结构（一）酶的结构：3.酶的活性中心(1)含义酶的活性中心：是指酶分子中与底物结合，并与酶的催化作用直接有关的部位。组成酶活性中心的氨基酸侧链基团主要有Glu和ASP的-COOH，Lys的ε-NH2，His的咪唑基，Ser的-OH，Cys的-SH，Tyr的侧链基团。结合部位：与底物结合的部位，决定酶的专一性 空间形状和氨基酸残基组成上，利于酶－底物复合物的形成。催化部位：底物的敏感键在此断裂并形成新键，决定酶的高效性与结合部位重叠或非常靠近；含有多种具有活性侧链的氨基酸残基；有的含有辅酶或金属离子；激活底物或降低过渡态活化能。(2)酶活性中心的形成

酶蛋白多肽链经过盘绕折叠形成特定的空间结构,使相关的氨基酸形成微区(3)酶活性中心的结构特征①活性中心是酶分子表面的一个凹穴,有一定的大小和特殊的构象,在与底物接触时表现一定的柔性②构成活性中心的大多数氨基酸残基为疏水性的,使此区形成一个非极性的微环境,有利于与底物作用。在活性中心仅有少数氨基酸残基以其功能基团直接与底物作用。活性中心的氨基酸在一级结构上相差很远,甚至不在一条肽链上,但在三级结构上比较靠近③在活性中心,底物以弱键与酶结合(有利于产物的形成)（二）根据酶的结构特点可将酶分为三种类型：1.单体酶（monomericenzyme）

：只有一条多肽链,分子量在13000-35000,一般是水解酶,如蛋白酶、羧肽酶2.寡聚酶（oligomericenzyme）

：由两个或两个以上的亚基组成，亚基间以非共价键相连，亚基可以相同也可以不同，分子量在35000-几百万，如丙酮酸羧激酶、乳酸脱氢酶3.多酶复合体（multienzymecomplex）

：由几个酶有组织地结合在一起，功能上相互配合，第一个酶的产物是第二个酶的底物。如丙酮酸脱氢酶、脂肪酸合成酶(三)酶原酶原:在细胞内某些初合成或分泌的酶没有催化活性.这种无活性状态的酶的前体称为酶原.酶原激活:酶原变成酶的过程(切去几个氨基酸肽段)

实质:酶活性中心的形成或暴露过程例：胃蛋白酶原（pepsinogen）的激活5.4酶促反应机制一、酶催化作用的本质1.活化能：底物分子变成可反应的分子所需要的能量。活化能可以看作是某一化学反应的能阈，使其分子变为活态状态，反应才能进行。

活化分子：达到或超过能阈的分子。化学反应的进行，与活化分子的数目成正比。在化学反应过程中使常态分子变为活化分子的途径：（1）加入一定能量如加热或光照射：直接增加活化分子的数目（2）用适当的催化剂降低活化能（能阈）：间接增加活化分子的数目。过渡态A*(活化态)在活化态时就能形成或打破一些化学健形成新的物质—产物(P)。酶与一般催化剂一样，使更多的分子进入活化态，降低反应的活化能，从而加速了反应的速度。酶催化作用的本质是降低反应的活化能。2.中间产物学说:

——酶降低活化能的机制非酶促反应：SP酶促反应：S+EES﹡EPE+P酶在催化过程中先与底物形成ES复合物，然后中间产物再生成反应产物这两步反应所需活化能均比非酶促反应低。（1）ES的形成使S分子内的某些化学键发生极化，呈不稳定状态(或称活化状态)，故反应的能阈降低(E+S→ES→P+E)所需的能量比(S→P)所需的小；（2）酶与底物多点结合形成ES后，引起各原子的电子分布情况发生改变，使底物的分子因受酶分子电荷的影响(或诱导)趋于不稳定状态，增加其反应性，结果活化能即随之降低。（1）静电引力（2）氢键

（3）疏水键相互作用：活性中心是相对的疏水环境酶－底物结合力3、与酶的高效性有关的因素（1）邻近定向效应：邻近效应：底物与酶活性中心邻近；底物分子反应基团邻近降低反应活化能，增加有效底物浓度反应速度上升定向效应：催化基团与结合基团正确定位；底物分子与酶活性中心定向锲合分子间反应类似于分子内反应，降低反应的活化能反应速度上升

（2）张力效应与底物变形酶与底物诱导锲合过程中，酶受底物诱导而变形，同时酶使底物中的敏感键产生张力或变形，使敏感键易于断裂（3）酸碱催化酶活性中心某些基团可作为良好的质子供体或受体进行酸碱催化。广义酸（质子供体）、广义碱（质子受体）—COOH—COO-—NH3+—NH2—SH—S-

酚羟基咪唑基（组氨酸，很多酶的活性中心）酸碱催化（acid-basecatalysis）酚吡啶α－羟基吡啶（4）共价催化（covalentcatalysis）：某些酶在催化过程中能通过共价键与底物形成不稳定的酶—底物复合物，这个中间产物很容易变成过渡中间物，反应活化能大大降低。1）亲核催化：酶分子中具有非共用电子对的亲核基团攻击底物分子中具有部分正电性的原子，并与之作用形成共价键而产生不稳定的过渡态复合物，活化能降低。亲核基团如丝氨酸的羟基、半胱氨酸的巯基，组氨酸的咪唑基。2）亲电催化：亲电基团：Zn2+、Fe3+、Mg2+、NH3+（5）酶活性中心是低介电区域（疏水的微环境）酶活性中心是低介电区，有利于使底物分子的敏感键与酶的催化基团之间形成很大的反应力二、酶专一性的作用机理1.锁钥学说:1890Fisher认为底物分子或底物的一部分像钥匙那样专一地锲入到酶的活性中心部位，即底物分子进行化学反应的部位与酶的活性中心有紧密互补的关系。但该学说不能解释酶活性中心的结构与底物和产物的结构都相吻合的现象，也不能解释酶专一性中的所有现象。2.诱导锲合学说：1958年Koshland提出“诱导锲合学说”：底物的结合可诱导酶活性中心构象的变化，使酶的活性中心与底物锲合而形成中间络合物。（电镜和X射线衍射证实）酶与反应过渡状态的结合作用酶与反应过渡状态的亲和力远大于酶与底物或产物的亲和能力酶促反应速度的概念酶活力及其测定影响酶促反应速度的因素5.5影响酶促反应速度的因素一、酶促反应速度的概念

酶促反应速度是指单位时间内产物的生成量或单位时间内底物的消耗量V=[P]/tV=[S]/t

研究酶促反应的速度以及各种因素对反应速度的影响，其中酶与底物之间的作用问题是研究酶促反应的核心问题。二、酶活力及其测定（一）酶活力（enzymeactivity）的表示方法1.酶活力—V：酶活力也称酶活性，是指催化一定化学反应的能力。通常用最适条件下所催化的化学反应的速度来确定。2.酶活力单位—U：

标准条件下，1min内催化转化为产物的酶量，或是转化1微摩尔底物中有关基团的酶量定义为一个酶活力单位。

单位：µmol/min

实质：酶所催化反应的初始速度

Kat:1Kat是指在最适条件下每秒钟催化1摩尔底物转化所需要的酶量。1Kat=6×107U3.酶的比活力（specificactivity)酶的比活力：每mg酶蛋白所含的酶活力单位或每kg蛋白中所含的Kat数单位：u/mg实质是表示酶制剂纯度的指标4.酶的转换数（Kcat）Kcat：酶充分被底物饱和时每个酶分子在单位时间（秒）内催化的底物分子数。单位：时间的倒数，s-1

相当于底物—酶中间物形成后，酶将底物转换为产物的效率。（二）酶活力的测定

测定酶活力时应注意几点（1）应测反应初速度（2）酶的反应速度一般用单位时间内产物的增加量来表示。（3）测酶活力时应使反应温度、pH、离子强度和底物浓度等因素保持恒定。（4）测定酶反应速度时，应使[S]>>[E]。产物浓度[P](t)三、影响酶促反应速度的因素

——酶促反应动力学

酶催化的反应中各成份的变化S+EESE+PS:substanceP:productE:enzyme发生在很短的时间内

（一）底物浓度对酶促反应速度的影响

1．底物浓度对反应速度的影响米氏方程（MichaelisMentenequation）的提出人们发现底物浓度的改变，对酶反应速度的影响比较复杂，在温度、pH和酶浓度固定时，将初速度(V)对底物浓度[S]作图。渐近的当底物浓度低时，酶量很多，底物可以尽量地与酶结合发生反应，酶促反应成直线上升，我们把这一段的反应叫一级反应(firstorderreaction)，即[S]↑，V↑，成直线上升。随着底物浓度的增加，反应速度也增加，但不是成直线上升,这时叫做混合级反应(mixedorderreaction)到了一定的底物的浓度，如果再增加底物浓度，反应速度不再上升，达到了最大反应速度，反应速度没有变化，这时叫做零级反应(zeroorderreaction)。这时的反应速度已经达到最大反应速度Vmax。OABC

2.米氏方程

为了解释这种现象，人们提出各种假说，其中比较合理的是中间产物学说，认为:

酶与底物先络合成一个络合物，此中间产物亦被人们看作为稳定的过渡态物质。然后络合物再进一步分解，成为产物和游离态酶:

E+S

ES

P+E

这个方程表明了底物浓度与酶促反应速度间的定量关系。现在一般称为“米氏方程”（MichaelisMentenequation

）。

1913年，Michaelis,Menten在前人工作的基础上，提出了酶促动力学的基本原理，并归纳为一个数学式加以表达:

酶与底物作用，形成酶—底物(中间产物)(ES):

E+S

[ES]→E+P

在稳态时ES的生成速度与ES的分解速度相等:

V1=k1[E][S]生成速度V2=K2[ES]+K3[ES]=(K2+K3)[ES]分解速度

V1=V2

K1[E][S]=(K2+K3)[ES]米氏方程的推导

将(2)式代入(1)式，得

([Et]-[ES])[S]/[ES]=Km[Et][S]/[ES]=Km+[S][ES]=[Et][S]/Km+[S]（3）令Km=(K2+K3)/K1

[E][S]/[ES]=Km在一个反应体系中[E]、[ES]都很难测定，想办法去掉：

[Et]=[E]+[ES]

(1)所以[E]=[Et]-[ES]

(2)

在稳态时酶促反应速度主要取决于ES的分解

V=V3=K3[ES]

V=K3[Et][S]/（Km+[S]）（4）

当[S]浓度很高时，所有的酶被底物饱和，而转变成[ES]，即[Et]=[ES]时,反应速度达到最大，

Vmax=K3[Et]

（5）用（4）除以（5）得到：(1)[S]很小时，[S]《Km则V=Vmax[S]

/Km一级反应（2)[S]很大时，[S]》Km则V=Vmax零级反应（3)[S]处于Km附近时，混合级反应①Km是酶的特征常数之一。只与酶的性质有关，而与酶浓度无关。②Km的数值等于当酶反应速度达到最大反应速度的一半时的底物浓度，它的单位与底物浓度单位一样mol.L-1。

1/2Vmax＝Vmax[S]/（Km+[S]），1/2=[S]/(Km+[S])所以：[S]＝Km③可确定酶的最适底物。如果一种酶有几种底物，就有几种Km值，Km值最小的底物称该酶的最适底物。3.米氏常数Km

（1）Km的意义④1/Km可以近似地表示酶对底物亲和力的大小。当K2>K3时，

1/Km愈大，Km愈小，达到最大反应速度一半时所需浓度就愈小，酶和底物亲和力就越大。碳酸酐酶胰凝乳蛋白酶Km值随不同底物而异的现象可以帮助判断酶的专一性，并有助于研究酶的活性中心。⑤据已知Km的值，应用米氏方程即可计算任意底物浓度时的反应速度，或任意反应速度下的底物浓度。e.g.反应速度是Vmax的90%，按照米氏方程计算其底物浓度:90%=100%[S]Km+[S]

∴[S]=9Km（2）米氏常数的测定——双倒数作图法或Lineweaver-Burk法为了得到准确的Km，把米氏方程的形式改为直线形式，相当于y=ax+b，然后用图解法求出Km。实验时选择不同的[S]测定相对应的V，求出两者的倒数，即以1/v对1/[S]作图，绘出直线。

双底物双产物反应

A+B P+Q双底物双产物的反应按动力学机制可分为两大类:双底物双产物的反应序列反应（sequentialreactions）乒乓反应（pingpongreactions）有序反应（orderdreactions）随机反应（randomreactions）（二）温度对酶作用的影响酶的最适温度（optimumtemperature,Tm）在一定范围内，反应速度达到最大时的温度称为酶的最适温度（optimumtemperature,Tm）。最适温度不是酶的特征物理常数，也不是固定值，而与底物种类、作用时间等因素有关。植物酶40-50℃，动物酶35-40℃。ｐＨ值最适ｐＨ活性(1)在达到最适温度之前，提高温度可以增加活化分子数量，提高酶促反应的速度。反应温度提高10℃其反应速度与原来的反应速度之比称为反应的温度系数，用Q10表示，对于许多酶来说，Q10多为1-2，也就是说每提高10℃反应速度是原来的1-2倍。(2)如果在超过最适温度时，继续提高温度，随温度的提高使酶逐步变性，大部分酶在60℃以上变性，酶的最适温度就是这两种过程平衡的结果，在低时，前一种效应为主，在高于最适温度时，后一种效应为主。（三）pH对酶作用的影响

pH对酶促反应速度的影响，主要有下列原因：1影响酶和底物的解离2影响酶分子的构象3ES复合物的形成最适pH4-8植物5.5-6.5，动物6.5-8.0最适值受酶的纯度、底物的种类和浓度、缓冲液的种类和浓度等因素的影响胃蛋白酶（四）酶浓度对酶作用的影响k1k2k3在酶促反应中,如果底物浓度足够大,足以使酶饱和,则反应速度与酶浓度成正比。（五）激活剂对酶作用的影响凡能提高酶的活性，加速酶促反应进行的物质都称为激活剂或活化剂(activator)，其中大部分是离子或简单有机化合物。1.无机离子，可分为三类：

(1)金属离子,原子序号在11-55之间，K+、Na+、Mg++、Zn++；

(2)阴离子,α-淀粉酶受Cl-激活；

(3)H离子。能激活胃蛋白酶2.有机分子，可分两类：

(1)某些还原剂：GSH、半胱氨酸；

(2)EDTA；金属螯合剂，能除去酶中的重金属杂质，解除抑制。3.具有蛋白质性质的大分子物质

蛋白酶酶原

酶一般认为，激活剂的作用主要有以下几个方面：1．解除抑制剂的抑制作用2．辅酶和辅基是构成某些有活性的全酶的必要组成成份3．无机离子激活许多酶类（六）抑制剂对酶作用的影响

与药物分子设计

1.抑制剂定义抑制作用：凡使酶活力下降，但并不引起蛋白变性的作用称为。所以,抑制作用与变性作用是不同的。

抑制剂：能引起酶活力下降，甚至丧失的物质。某些物质,能使酶分子上某些必需基因发生变化，因而引起酶活力下降，甚至丧失，致使酶反应速度降低。2.抑制剂作用机理

(1)底物类似物－－活性中心结合(2)非底物类似物－－不与活性部位结合，但和酶活性部位以外的必需基团结合，从而影响酶促反应过程。

3.抑制作用分类

根据抑制剂与酶作用方式的不同

(1)不可逆抑制（irreversibleinhibition)概念：抑制剂与酶活性中心必需基团以共价键结合，阻碍了底物的结合或破坏了酶的催化基团，不能用透析或超滤等方法去除抑制剂。分类：根据抑制剂对酶选择性的方式非专一性不可逆抑制：一种抑制剂可作用于酶分子上的不同基团或作用于几种不同的酶。例如：烷化剂类：碘乙酸酰化剂类：酸酐、磺酰氯专一性不可逆抑制Ks型：一种抑制剂只作用于酶分子中必需基团的一种氨基酸侧链基团。如：有机汞：专一作用于巯基；有机磷农药：专一作用于丝氨酸羟基，如乐果、敌百虫等。Kcat型：抑制剂为结构中潜藏着一种化学活性基团的底物类似物，在酶的作用下，该基团被激活，与酶的活性中心发生共价结合，不能再分解，酶因此失活。自杀性底物例：用自杀性底物对付抗青霉素的菌株青霉素分子：青霉素分子中，含有一个活泼的β-内酰胺环，它与一个噻唑环相融合。青霉素的作用机制是抑制细菌的细胞壁生物合成。细菌细胞壁的合成是在转肽酶催化下，通过肽聚糖的交联作用进行的。由于青霉素在结构上与转肽酶的天然底物肽聚糖的反应部位相似，所以能竞争性地与转肽酶的活性中心结合（与活性中心的丝氨酸残基形成共价键），从而抑制了细胞壁的合成。耐药性产生的原因青霉素在经过长期使用以后，能够诱导生物体（包括细菌等微生物）产生青霉素酶。青霉素酶能够水解β-内酰胺环，从而导致青霉素（G型和V型）失效青霉素酶β－内酰胺环与噻唑环融合解决耐药性的方法

科学家们在详细研究了青霉素酶的人用机制基础上，成功地解决了保持青霉素优良抗菌能力的问题。主要有两条途径：

（1）研制对青霉素酶具有抑制作用的青霉素产品；（2）研制对青霉素酶不敏感的青霉素新品种。对青霉素酶具有抑制作用的青霉素产品从微生物Strptomyces

clavuligerus中分离出的克拉维酸（clavulanic

acid）本身没有显著的抗菌活性，但是青霉素酶的将克拉维酸与对青霉素酶敏感的青霉素可以组合成新的青霉素制剂。现在这种类型的青霉素产品己经被广泛应用。自杀性底物

自杀底物：是在结构中含有一种化学活性基团的一类酶的天然底物的衍生物或类似物，当酶把它们作为底物结合时，其潜在的化学基团能被解开或激活，并与酶的活性部位发生共价结合，使结合物停留在某种状态，从而不能分解成产物，酶因而致“死”，此过程称为酶的自杀，这类底物称为自杀底物(suicidesubstrate)。

由链霉菌产生的cefoxitin，先锋霉素(或称为头孢菌素）类抗生素。由于分子中β-内酰胺环上连接的噻唑侧链基团和甲氧基的空间位阻作用，影响了与青霉素酶的结合,使其对青霉素酶的稳定性好

。青霉素酶催化的水解速率要比催化青霉素V的水解速率小将近150倍。对青霉素酶不敏感的青霉素新品种(2)可逆抑制（reversibleinhibition)概念：抑制剂与酶蛋白以非共价键结合，具有可逆性，可用透析、过滤等方法将抑制剂除去。结合部位可以是活性中心，也可以是非活性中心。分类：据抑制剂与底物是否竞争与酶的结合可分为：①竞争性抑制(Competitiveinhibition)与底物具有相似的化学结构，能竞争性的与酶的活性中心结合的抑制剂。与酶的非活性中心结合的抑制剂，同酶和底物的结合没有竞争作用。②非竞争性抑制

(noncompeti