第二章 基因工程

第二章基因工程一、绪论1、什么是基因？如何分类？什么是基因表达？2、什么是基因工程？它产生的背景是什么？它的应用前景如何？1、什么是基因？如何分类？什么是基因表达？

基因，在希腊语中是“给予生命”之意，1909年，丹麦生物学家首先使用名词“基因”代替“遗传因子”这个术语。1）经典的基因概念（Theoryofthegene）1926T.H.Morgan基因是染色体上的实体基因象链珠(bead)一样，孤立地呈线状地排列在染色体上基因是(Threeinone)

；功能(functionalunit)突变(mutationunit)

交换(cross-overunit)

“三位一体”的最小的不可分割的基本的遗传单位(1926T.H.Morgan)1910年始做果蝇杂交试验，发现“连锁遗传规律”,并概括提出“基因论”1、什么是基因？如何分类？什么是基因表达？

2）后来顺反子理论和操纵子理论的提出对经典的基因概念做了重要修正与发展。顺反子理论的重要理论基础：①“一个基因一个酶”假说1941Beadle&Tatum基因的化学本质就是DNA分子

1944Avery.O.T

顺反子学说：一个顺反子就是一个基因，这个基因或者编码蛋白质，或者编码RNA分子。在一个顺反子内，有若干个突变单位突变子

在一个顺反子内，有若干个交换单位交换子顺反子学说彻底否定了基因是决定遗传性状的功能单位和突变、重组的最小单位这样三位一体的概念。onegene→onefunction(Ribozyme,Abzyme,rDNA,tDNA..)

onegene→oneenzymeLac.Operon诱导物操纵子理论

(Lactoseoperon1961.Jacob,Monod)

基因功能的表现是若干基因组成的信息表达的整体行为IPOZYA

zonegene→onepeptideya1、什么是基因？如何分类？什么是基因表达？

3）基因：是一段含有特定遗传信息的核苷酸序列（或核酸片段），它是控制生物性状的功能和结构单位。1、什么是基因？如何分类？什么是基因表达？

4）从分子水平来说，基因有三个基本特性。

基因可自体复制1953年Watson-Crick提出了DNA双螺旋结构模型。说明了半保留复制机制，两股DNA彼此分开，以每一股为模板，按碱基配对的规则，各自配上一股新的DNA，复制便告完成。基因的一般特点

基因决定性状

生物体的表（现）型（phenotype）是指有机体可见的或可计算的外在性质，而基因型（genotype）是指控制这些表型的遗传因子。基因的一般特点

基因突变

基因通常是一个稳定的遗传单位，但它也可能发生可遗传的变异，这种变异叫基因突变（mutation）。突变以后的基因以新的形式稳定遗传。携带突变基因的生物体叫突变体（mutant），携带正常基因的生物体叫野生型（wildtype)。基因的一般特点5）、根据是否转录和翻译功能可分三类：一类是既有转录功能又有翻译功能的基因，这类基因是指编码酶和结构蛋白质的结构基因及编码阻遏蛋白的调节基因（统称为蛋白质基因）；第二类是只有转录功能而没有翻译功能的基因，包括编码tRNA和rRNA的基因；第三类是既不转录也不翻译的基因，包括启动基因、操纵基因、增强子等（有时也把它称为调控基因）。6）所以基因表达不能说就是遗传信息经转录和翻译从（DNA）传递到蛋白质的过程。基因表达：是基因表现其生物功能所经历的一系列分子转化和相互作用的过程。2、什么是基因工程？它产生的背景是什么？它的前景如何？

（1）、基因工程：应用DNA重组技术，按照人们的意愿，在基因水平上改变生物的遗传性状，创造新生物物种，通过工程化为人类提供有用产品及服务的技术。遗传工程：是包括基因工程在内的人工改造生物遗传性状的全部技术；DNA重组技术：是采用酶法，将不同来源DNA进行体外切割与连接构成杂种DNA分子：分子克隆：主要是指DNA分子在宿主细胞内的复制过程。三者之间有联系，但是有不同。（2）产生的背景：一方面是科学发展的必然要求（当时育种工作、癌等的治疗都要求科技应有所突破）；另一方面是有关基因结构与功能的基础理论研究的重大突破和技术的必然结果。（3）基因工程的成果和发展前景A、基因工程与医药卫生B、基因工程与农牧业、食品工业C、基因工程与环境保护A基因工程与医药卫生基因工程药品的生产许多药品的生产是从生物组织中提取的。受材料来源限制产量有限，其价格往往十分昂贵。微生物生长迅速，容易控制，适于大规模工业化生产。若将生物合成相应药物成分的基因导入微生物细胞内，让它们产生相应的药物，不但能解决产量问题，还能大大降低生产成本。基因工程胰岛素（一）胰岛素是治疗糖尿病的特效药，长期以来只能依靠从猪、牛等动物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰岛素，其产量之低和价格之高可想而知。胰岛素分子结构基因工程胰岛素（二）将合成的胰岛素基因导入大肠杆菌，每2000L培养液就能产生100g胰岛素！大规模工业化生产不但解决了这种比黄金还贵的药品产量问题，还使其价格降低了30%-50%!胰岛素生产车间其它基因工程药物人造血液、白细胞介素、乙肝疫苗等通过基因工程实现工业化生产，均为解除人类的病苦，提高人类的健康水平发挥了重大的作用。人造血液及其生产B基因工程与农牧业、食品工业运用基因工程技术，不但可以培养优质、高产、抗性好的农作物及畜、禽新品种，还可以培养出具有特殊用途的动、植物。转鱼抗寒基因的番茄转黄瓜抗青枯病基因的马铃薯不会引起过敏的转基因大豆超级动物导入贮藏蛋白基因的超级羊和超级小鼠特殊动物导入人基因具特殊用途的猪和小鼠C基因工程与环境保护基因工程做成的DNA探针能够十分灵敏地检测环境中的病毒、细菌等污染。1t水中只有10个病毒也能被DNA探针检测出来基因工程在环境监测上的应用基因工程与环境污染治理基因工程做成的“超级细菌”能吞食和分解多种污染环境的物质。通常一种细菌只能分解石油中的一种烃类，用基因工程培育成功的“超级细菌”却能分解石油中的多种烃类化合物。有的还能吞食转化汞、镉等重金属，分解DDT等毒害物质。A重组DNA技术的理论基础二基因工程的基本原理19世纪中孟德尔

豌豆杂交试验

遗传因子

经典遗传学20世纪初摩尔根

果蝇杂交实验

基因

基因学1944年艾弗瑞

肺炎双球菌转化实验

遗传物质DNA1973年伯格-杰克森-考恩-鲍耶

DNA分子体外拼接分子遗传学1953年沃森-克瑞克

DNA双螺旋结构

分子生物学基因工程B基因的分子生物学二基因工程的基本原理C基因工程的基本原理提高外源基因的剂量——分子遗传学原理筛选修饰重组基因表达的转录调控元件，如：启动子、

增强子、操作子、终止子、上游调控序列等列、mRNA非编码区、密码子等——分子生物学原理

修饰构建蛋白质生物合成的翻译调控元件，如：SD序

基因工程菌（微型生物反应器）的增殖及稳定生产——生化工程学原理

——分子生物学原理

D基因工程的支撑技术核酸凝胶电泳技术核酸分子杂交技术细菌转化转染技术DNA序列分析技术寡核苷酸合成技术基因定点突变技术聚合酶链反应（PCR）技术三基因工程的基本条件C用于基因转移的受体菌或细胞B用于基因克隆的载体A用于核酸操作的工具酶A用于核酸操作的工具酶限制性核酸内切酶DNA连接酶DNA聚合酶核酸酶核酸修饰酶（一）、工具酶：基因工程中所使用的酶类。1、限制酶：凡能识别和切割双螺旋DNA分子内特定核苷酸顺序的酶类，全称是限制性核酸内切酶（1）、限制性核酸内切酶的发现：寄主控制的限制和修饰现象（R/M体系）因此发现了两种酶：核酸内切酶：破坏外源DNA，使之迅速降解；

甲基化酶：保护自身DNA不受限制。

1968年，Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分离出HindII和HindIII

限制性核酸内切酶的生物功能识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链；主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵（2）限制性核酸内切酶的命名属名种名株名HindIIIHaemophilusinfluenzae

d嗜血流感杆菌d株同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶根据属名和种名相结合的原则，即取细菌属名的第一个字母（大写）+种名的前两个字母（小写）表示。（若有株名时，用株名第一个字母置于三字母后）（3）核酸限制性内切酶的类型根据识别序列和切割位点的一致性，分为3类：

其中II型酶的核酸内切酶活性和甲基化作用是分开的，且具有序列特异性，在基因克隆中广泛使用。II型限制性核酸内切酶的基本特性识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构5‘…GCTGAATTCGAG…3’3‘…CGACTTAAGCTC…5’EcoRI的识别序列EcoRI的切割位点具有很强的底物专一性，其底物只能是双链DNA分子，对单链RNA及双链DNA-RNA杂交分子均不起作用；EcoRI等产生的5‘粘性末端5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRI37℃5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’退火4-7℃5‘…G-C-T-G

A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A

G-C-T-C…5’OHPOHPPstI等产生的3‘粘性末端5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’PstI37℃5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-P

OH-A-C-G-T-C-C-T-C…5’退火4-7℃5‘…G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’OHPOHPPvuII等产生的平头末端5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…5’PvuII37℃5‘…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C…5’

(4)：影响限制酶活性的因素：底物的纯度；纯度高则酶活性强DNA的甲基化程度；甲基化程度高则酶活性弱DNA分子结构；环状双螺旋DNA分子较线性DNA稳定，所需酶量较线性多。反应温度；

大多数为37℃，特别：SmaI：25，ApaI：30，MaeI：45反应缓冲液。终止限制酶反应的方法：加热失活，65℃保温5分钟；如是耐热酶，则可用脲、SOS、及胍等变性剂使之失活。2、DNA连接酶及T4-DNA连接酶问题：什么是连接酶？两种连接酶各有什么特点？能催化DNA片段5‘-磷酰基与3’-羟基形成磷酸二酯键的酶。T4-DNA连接酶是T4-噬菌体编码的一种重要连接酶特点：DNA连接酶只能封闭缺口，而不能封闭裂口；只能连接粘性末端，不能连接平整末端。T4-DNA连接酶既能连接粘性末端，又能连接平整末端。但用量大。DNA连接酶(ligase):催化2条链3’-OH和5’-P之间形成磷酸二酯键。DNA连接酶的活性能封闭nick，而非gap反应温度：37℃为最佳温度26℃反应4小时4℃过夜

nickgap3、DNA聚合酶：将脱氧核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3’-OH末端，催化核苷酸的聚合。（1）大肠杆菌DNA聚合酶I(E.coli.DNAPolI)

特点：5’-3’DNA聚合酶活性：Mg2+、单链DNA模板、3’-OH末端3’-5’外切酶活性：识别消除不配对碱基5’-3’外切酶活性作用DNA缺口转移（2）大肠杆菌DNA聚合酶I大片段(Klenow片段)特点5’-3’聚合酶3’-5’外切酶应用用同位素标记DNA片段的末端补平粘末端合成cDNA第二链Sanger双脱氧法进行序列测定定位突变B用于基因克隆的载体

问题：什么是载体？做为载体必须符合哪些条件？基因工程为什么要用载体？什么是受体、克隆和重组体（重组子）？载体：能将目的基因运载进生物细胞并在其中自我复制的遗传因子。

载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件载体应具备的条件在细胞中能自我复制，即本身是复制子(可繁殖性)；具有一种或多种限制酶的单一切割位点，并在此位点中插入外源基因片断后，不影响其本身的复制功能(可利用性)；在基因重组中有1-2个筛选标记从而容易进行选择(具有便利性)；分子小，多拷贝，安全性好，适应性强，容易控制，便于表达。在基因工程中，载体一般是用天然质粒或病毒为材料，经过人工改造或重新构建而成，改造的目标：1、质粒改小(增加有效装载量和拷贝数)2、减少相同的限制酶切点，使载体适合于多种限制性酶的切割3、引入强的复制原点，构建克隆载体4、引入强的启动子和其它表达序列，构建表达载体。5、引入两种不同的复制原点，构建穿梭载体。1、质粒载体（PlasmidUector）：质粒的基本特征质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子质粒常见于原核细菌和真菌中绝大多数的质粒是DNA型的绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即cccDNA质粒DNA的分子量范围：1-300kb质粒的自主复制性质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：严紧型复制控制的质粒1-3拷贝松弛型复制控制的质粒10-60拷贝质粒的不相容性任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质以大肠杆菌的质粒为例：ColE1、pMB1拥有相似的复制子结构，彼此不相容粒组成不相容性群粒的不相容性，不相容性的质质粒的可转移性革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：接合型质粒能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如F、R、Col质粒等非接合型质粒不能在天然条件下独立地发生接合作用(用做基因工程的载体更为安全)值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由bom和mob基因决定携带特殊的遗传标记野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义质粒的分类人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类：高拷贝质粒突变拷贝数控制基因拷贝数1000-3000扩增基因低拷贝质粒来自pSC101拷贝数小于10表达某些毒性基因温敏质粒在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质测序质粒含有测序通用引物互补序列和多酶接头polylinker整合质粒装有整合促进基因及位点便于外源基因的整合穿梭质粒装有针对两种不同受体的复制子便于基因克隆表达质粒装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件探针质粒装有报告基因便于启动子等元件的克隆筛选PBR322质粒：PBR322质粒是大肠杆菌质粒载体，有万能质粒载体之称。它是由PSF2124、PMB8、PSC101三个亲本质粒经过复杂的重组构成的。PSF2124—带有氨苄青霉素抗菌素基因（Ampr）；PMB8—带有ColEⅠ松驰型复制子；

PSC101—带有一个四环素抗性基因（Tetr）。因此PBR322质粒是一个带有（Ampr）和（Tetr）标记的松驰型质粒载体。重要的大肠杆菌质粒载体松弛型复制pBR322：2.6x106道尔顿拷贝数50-100/cell用于基因克隆2、噬菌体或病毒DNA噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效高特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。噬菌体或病毒的DNA能被开发成为基因工程的载体，因为：高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增大肠杆菌的l噬菌体DNAl噬菌体的生物学特性：生物结构l噬菌体由外壳包装蛋白和l-DNA组成

l-DNA全长48502个核苷酸l-DNA上至少有61个基因大肠杆菌的l噬菌体DNAl噬菌体生物学特性：感染周期E.coli吸附LamB受体注入复制包装裂解大肠杆菌的l噬菌体DNAl噬菌体生物学特性：溶源状态

l噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上，并不产生子代噬菌体颗粒，这种情况为溶源状态。人们可以根据需要改变l-DNA或宿主细胞的性质，使噬菌体或处于溶菌状态，或处于溶源状态。DNA重组技术一般需要l噬菌体进入溶菌状态大肠杆菌的l噬菌体DNAl-DNA载体的构建：缩短长度

野生型l-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型l-DNA的长度，可以提高装载量。其实野生型l-DNA上约有40-50%的片段是复制和裂解所非必需的。大肠杆菌的l噬菌体DNAl-DNA载体的构建：删除重复的酶切位点野生型的l-DNA链上有5个EcoRI位点和7个HindIII位点，不利于重组操作，必须删除至1-2个同时，为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还需要增加一些单一的酶切位点大肠杆菌的l噬菌体DNAl-DNA载体的构建：加装选择标记与质粒不同，野生型l-DNA上缺少合适的选择标记，因此加装选择标记是l-DNA克隆载体构建的重要内容l-DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类：免疫功能类标记颜色反应类标记大肠杆菌的l噬菌体DNAl-DNA载体的构建：加装选择标记lacZlacZ基因编码b-半乳糖苷酶，能催化无色的X-gal生成蓝色化合物。当外源基因插入到lacZ基因中，基因灭活，不能合成蓝色化合物；而空载体l-DNA则产生蓝色透明斑。l-DNA作为载体的优点：l-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌

l-DNA载体的装载能力为25kb，远远大于质粒的装载量

重组l-DNA分子的筛选较为方便

重组l-DNA分子的提取较为简便

l-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达外源基因受体：用于扩增载体及目的基因的细胞。克隆：目的基因的扩增过程。重组体（重组子）：携带重组DNA分子的受体细胞。对受体要求：

※对人体无害：※繁殖能力强、生长速度快、从而在短时间内能产生大量的后代，得到大量的基因拷贝和产物；※限制系统缺陷，对外来DNA不降解；

※有蛋白质的加工修饰