第七章++基因治疗

第七章基因治疗湖南师范大学生命科学学院袁婺洲本章目录7.1基因治疗的概念与发展7.1.1基因治疗的概念与策略7.1.2基因治疗的基本程序7.1.3基因治疗的现状与展望7.2基因治疗的载体7.2.1病毒载体7.2.2非病毒载体7.2.3载体与基因治疗中的靶向性问题7.3重要疾病的基因治疗7.3.1遗传病的基因治疗7.3.2肿瘤的基因治疗7.3.3病毒病的基因治疗

第一节基因治疗的概念与发展

基因治疗的概念与策略基因治疗的基本程序基因治疗的现状与展望一、

基因治疗的概念

基因治疗（genetherapy）——就是向有功能缺陷的细胞补充相应功能基因，以纠正或补偿其基因缺陷，从而达到治疗的目的。NakedDNATargetCellTherapeuticProteinAAVRetrovirus/LentivirusAdenovirusNucleusGeneTherapyPrinciples基因治疗的前提条件

发病机制在DNA水平上已经清楚要转移的基因已经克隆分离，其表达产物有详尽的了解该基因正常表达的组织可在体外进行遗传操作基因治疗的策略

1）基因置换，就是用正常的基因原位替换病变细胞内的致病基因，使细胞内的DNA完全恢复正常状态。2）基因修复，是指将致病基因的突变碱基序列纠正，而正常部分予以保留。3）基因修饰，又称基因增补。是将目的基因导入病变细胞或其他细胞，目的基因的表达产物能够修饰缺陷细胞的功能或使原有的某些功能得到加强。4）基因失活，利用反义RNA、核酶或肽核酸等反义技术及RNA干涉等技术能特异地封闭基因表达的特性，抑制一些有害基因的表达，以达到治疗疾病的目的。5）免疫调节，这是将抗体、抗原或细胞因子的基因导入病人体内，改变病人的免疫状态，从而达到预防和治疗疾病的目的。基因治疗的两种途径

1）exvivo法，是将受体细胞在体外培养，转入外源基因，经过适当的选择系统，把重组的受体细胞回输到患者体内，让外源基因表达以改善患者症状。2）invivo法，直接将外源DAN注射到机体内，使其在体内表达发挥治疗作用。invivo法比exvivo法更简单、直接和经济，疗效也比较确切，常用的体内基因直接转移手段有病毒介导，脂质体介导和基因直接注射等。二、基因治疗的基本程序

基因治疗的主要步骤①目的基因的克隆②基因转移系统的建立③靶细胞的选择④基因的导入。1.目的基因的选择和制备

用于基因治疗的基因必须满足以下条件：1）在体内仅有少量表达就可以显著改善症状；2）该基因的过高表达不会对机体造成危害；3）外源基因可有效导入靶细胞4）外源基因能在靶细胞中长期稳定存留5）导入基因的方法及载体对宿主细胞安全无害2.靶细胞的选择

1）生殖细胞基因的转移只能用显微注射，效率不高，并且只适用于排卵周期短而次数多的动物，不适用于人类。所以，这种靶细胞的遗传修饰至今尚无实质性进展。2）体细胞采取基因置换、基因修复等方式，但还不能实现特定位点的基因转移。只能采取基因在基因组上非特定定位，随机整合的方式。只要基因能表达产物就可以达到治疗的目的。是一种异常基因功能补偿的基因治疗方式。

靶细胞的选择

最好为组织特异性细胞细胞较易获得，且生命周期较长离体细胞较易受外源基因转化离体细胞经转染和一定时间培养后再植回体内，仍较易成活常用的靶细胞造血细胞皮肤成纤维细胞肝细胞血管内皮细胞淋巴细胞肌肉细胞肿瘤细胞3.转移载体的选择与细胞转染病毒感染、显微注射、电穿孔、化学转染试剂等。4.外源基因的表达及检测第二节基因治疗的载体

病毒载体非病毒载体载体与基因治疗中的靶向性问题一、病毒载体逆转录病毒载体腺病毒载体(AV)腺伴随病毒载体（AAV）逆转录病毒载体

retrovirus5’LTRLTR3’U3RU5U3RU5ψ小鼠白血病病毒(Mo-MLV)gagpolenv病毒核心逆转录酶外壳蛋白抗原基因基因基因逆转录病毒逆转录病毒载体的构建(缺陷型病毒)5’LTRLTR3’U3RU5U3RU5ψ小鼠白血病病毒(Mo-MLV)外源目的基因逆转录病毒(retrovirus)逆转录病毒载体的构建(缺陷型病毒)逆转录病毒(retrovirus)逆转录病毒载体的包装RNAψ-HelpervirusPackagingcellRNAPackagingproteinVirusRecombinantvirusψ+逆转录病毒的优缺点

优点能高效转染宿主细胞，转染率可达100％宿主范围广泛可转染大量细胞并长期停留，病毒基因和所载的外源基因都能表达

缺点病毒容量有限(7kb)随机插入有致癌作用2.腺病毒载体(AV)

腺病毒的结构

蛋白质外壳包囊外壳蛋白：由纤维状蛋白分子和角蛋白组成骨架蛋白：起着保持包囊形状的作用DNA结合蛋白：与DNA结合线性双链双螺旋病毒DNAAdenovirus36kbDoubleStrandedDNAGenomeEntrythroughCARreceptorandintegrinco-receptor腺病毒基因组DNA基因组长36kb，两端各有一个ITR，ITR内侧为病毒包装信号。6个早期转录基因：E1a,E1b，E2a,E2b，E3,E4，承担基因调控功能1个晚期转录单元(5个晚期基因L1-L5)：负责结构蛋白的编码。E1的缺失可能造成病毒再复制阶段的流产，E3为复制非必须区，可被外源基因替代。基因组DNA长36kb，两端各有一个ITR，ITR内侧为病毒包装信号。ITRITRE1E2E3E4IVa2VAL1L2L3L4L5ITR是反向重复序列E1-E4为早期基因，与病毒基因组的复制及晚期基因的,表达调控有关，其中E3编码晚期基因的调控因子

L1-L5为编码病毒包装蛋白的晚期基因IVa2和VA均为病毒RNA聚合酶的亚基编码基因。腺病毒载体的构建第一代腺病毒载体缺少E1a和E1b基因，取代的是治疗基因。包装细胞基因组含有E1基因；但第一代腺病毒载体产生炎症，而且基因表达快速衰退；第二代腺病毒载体在删除E1的基础上，或者突变E2区或直接除掉E2或E4区，基因型为E1－\E2－或E1－\E4－。由于保留有E3区，可抑制宿主的免疫反应。第三代腺病毒载体正在开发，目的是尽可能多删除全部的反式序列基因，以降低病毒基因的表达，但腺病毒载体的生产及治疗基因在细胞内的稳定性可能有影响。腺病毒载体的包装E1E3DNAE3Cell293腺病毒的包装Cell293DNAE3腺病毒的优缺点

优点插入DNA片段较长宿主范围广，不需要正在分裂的细胞不整合，减少插入突变的潜在危险

缺点需反复给药具有免疫原性腺病毒(adenovirus)载体的优点复制缺陷型病毒可感染分裂和非分裂细胞病毒颗粒稳定，易于浓缩和纯化可导入多种靶细胞，并持续表达无致癌性GelsingerCaseJesseGelsinger:18yr-oldfromArizona,diedon9/17/1999,4dayaftergenetransfer.他患有鸟氨酸转氨甲酰酶不足症（OTCD）

接受3.8×1013腺病毒载体，1％到达靶器官肝脏3.腺伴随病毒载体（AAV）

腺伴随病毒属于细小病毒科，病毒颗粒直径为20nm，无包膜，20面体。是一类单链线状DNA病毒。AAV感染率很高，而且尚无发现AAV引起人体疾病的报道，相反，AAV感染者减少了患癌的机会。

腺伴随病毒载体的基因组AAV基因组很小，两端也是ITR，中间含有3个启动子和2个编码基因（rep和cap）。REP参与病毒复制、转录的调节，并与基因组的整合有关。而CAP是病毒衣壳蛋白。AAV是一种缺陷病毒，只有在与腺病毒等辅助病毒共转染时才能进行有效复制和产生溶细胞感染。在人体，AAV特异整合到19号染色体上，是唯一一种以位点特异性方式整合的真核病毒，从而避免了随机整合而导致宿主细胞突变的潜在危险性。AAV载体是缺失病毒结构基因，仅保留两个ITR。使用AAV载体安全，但缺乏高效的包装细胞。

腺伴随病毒载体构建二非病毒载体

1.裸露DNA2.脂质体法1.裸露DNA

直接注射溶液类型对基因表达有影响：重组DNA可贮存于5%~30%的蔗糖溶液中也可用生理盐水或PBS直接注射法裸露DNA的转移方法电穿孔法微粒子轰击法2.

脂质体法人造单层膜，是一种脂质双层包围水溶液的脂质微球.结构和性质与细胞膜极为相似，二者易于融合，DNA由于细胞的内吞作用进入细胞。Liposomes

优点稳定可携带大片段外源DNA可选择特异的靶细胞无免疫原性

缺点转染效率较低瞬时表达血清抑制脂质体的优缺点GeneTherapy:DeliveryVehicle第三节重要疾病的基因治疗

遗传病的基因治疗肿瘤的基因治疗病毒病的基因治疗一、遗传病的基因治疗血友病Bβ地贫囊性纤维化腺苷脱氨酶缺乏症1.血友病B凝血因子IX缺乏引起，不能正常凝血薛京伦(复旦大学)1991,腺病毒皮肤成纤维细胞FactorIX:提高5%2003,rAAV2-hF.IXβ地贫是由于β珠蛋白基因突变或缺失造成，β珠蛋白肽链合成减少，引起患者溶血性贫血。2.β地贫β地贫的基因治疗基因转移的治疗

向患者的造血干细胞导入正常的β珠蛋白基因反义核酸修复

通过反义核酸与目标mRNA特异性杂交，导致异常表达的mRNA降解，或修饰mRNA的剪接或阻碍的翻译。cftr基因突变引起正常的CFTR引导氯离子穿过细胞膜患者肺细胞分泌过量的黏液，呼吸困难Achildwithcysticfibrosis3.囊性纤维化（CF）CysticFibrosis:FindingtheGene囊性纤维化的治疗压缩DNA技术直接将正常DNA导入细胞，补偿患者缺乏的CFTR蛋白4.严重免疫缺陷症(SCID)1990.9.14首例基因治疗4岁女孩严重免疫缺陷症(SCID)缺乏腺苷酸脱氨酶(ADA)2--脱氧腺苷含量升高毒性严重破坏免疫功能AshantideSilva严重免疫缺陷症(SCID)的治疗FrenchAnderson(NIH)LTRADASV40neoLTRSeptember14,1990Retrovirus(Mo-MLV)ADA基因LN逆转录病毒载体靶细胞为病人淋巴细胞回输Adenosinedeaminase二肿瘤的基因治疗1.针对抑癌基因治疗肿瘤患者50％是由于抑癌基因突变导致将正常的抑癌基因导入肿瘤细胞中，以补偿和代替突变或却失的抑癌基因。

p53,p16,2.针对癌基因治疗癌基因是指基因组