棉花黄萎病防治药剂ncd-2菌株的筛选、鉴定与应用

棉花黄萎病防治药剂ncd-2菌株的筛选、鉴定与应用

由于daliyi亚美菌（daliyi亚美酸）引起的棉花萎缩是棉花的重要疾病之一，因此很难进行治疗。当前国内外在抗病育种、农业措施和化学防治等方面做了大量工作,但由于这些防病措施的种种弊病,收效不尽人意。目前,生物防治被认为是最具有发展潜力的防治方法之一。NCD-2是自棉花根围土壤分离到的一株细菌菌株,抑菌作用测定结果证明该菌株对16种植物病原真菌有抑制作用,其中对棉花黄萎病病原菌(V.dahliaeKleb.)的抑菌率为57.4%。通过室内盆栽试验证明,用NCD-2菌株悬浮液(108cfu/mL)对棉花种子浸种处理能够极显著地降低棉花黄萎病的病情指数,防病效果达到77.0%。本文着重通过田间小区试验和大区示范,测定了NCD-2菌株对棉花黄萎病的防治效果。同时,对该菌株进行了分类鉴定并对主要农作物的安全性进行了测定,为进一步应用该生防细菌提供理论依据。1材料和方法1.1试验材料NCD-2菌株:河北省植保所棉花黄萎病病圃中棉花根围土壤分离获得。1.2黄现有病毒基因观察和测定本试验1999年和2000年在位于保定市的河北省植保所棉花黄萎病病圃进行。试验处理为用NCD-2悬浮液(109cfu/mL)包衣棉花种子(品种为DP99B,市购,下同),栽培方式为育苗移栽,操作方法见文献。以清水湿润种子、穴中灌入清水为空白对照,以PROTUSue617WG(一种以黄色蠕形霉Talaromycesflavus为有效活性成分的微生物农药,在德国注册登记用于防治蔬菜黄萎病,由PROPHYTABiologischerPflanzenschutzGmbH,Germany生产并惠赠)拌种处理(1∶20,w/w)为对照药剂。每小区15m2,重复3次,随机排列。在棉花花铃期,即黄萎病发生高峰时期,调查黄萎病发生情况。病株级别调查方法及病情指数和防治效果计算方法见文献。1.3推广种子栽培技术采用棉花育苗移栽和平播2种栽培方式,对NCD-2粉剂(主要添加物为草炭,109cfu/mL)进行了防治棉花黄萎病田间大区示范。其处理方法、防治效果调查和测产方法分述如下:1.3.1育苗移栽栽培方式中生防细菌防治棉花黄萎病试验本试验2000年在河北省永年县陈刘营村进行。在大田棉花播种前10d,按照1∶20(w/w,菌剂/种子量)的比例将NCD-2粉剂与棉花种子拌种:将棉花种子用水打湿,把粉剂撒入种子中,拌匀晾干,播种于营养钵中并在塑料拱棚中育苗。4个星期后(2片真叶)移栽到棉田。移栽时在每穴中加入NCD-2粉剂100倍细土稀释物1g。种子不经任何处理为空白对照。每处理面积666.6m2。1.3.2平播栽培方式中生防细菌防治棉花黄萎病试验本试验设在山东省宁津县保店村(2001年)和新疆一四七团(2002年),试验处理同1.3.1,播种方法、时间和棉花田间管理同当地操作。种子不经任何处理为空白对照。每处理面积666.6m2。1.3.3病情调查和产量估算方法在当地棉花黄萎病的发病高峰期,应用5点取样法(30株/点)进行病情调查,并计算病情指数和防治效果。在棉花收获前应用5点取样法(20株/点)调查单株结铃和密度,对棉花进行估产。产量(kg/hm2)=密度×单株结铃×0.004(其中系数0.004为DP99B品种的单铃重,单位kg)1.4致病性和不良影响研究为了明确NCD-2对主要大田作物的影响,测定了该生防菌对主要大田作物(小麦、玉米、棉花、马铃薯、黄瓜、茄子、大豆)的致病性和不良影响。试验采用室内接种方法测定:播种前,分别按照NCD-2粉剂/种子(种薯)为1∶100、1∶20、1∶10(w/w)拌种,设不用菌剂处理的种子为空白对照。出苗后15d,再用5%菌剂的水悬浮液进行相应喷雾,空白对照用水喷雾。各处理重复4次,每重复30棵苗。30d后,观察幼苗的反应。1.5数据的统计分析本文有关数据的统计分析采用SAS6.04版本软件(SASInstituteInc.)。1.6菌株鉴定ames将待鉴定细菌接种在NA(Nutrientagar,DifcoLaboratories)平板上,30℃培养24h,然后用无菌刮铲收集菌体,并用0.85%无菌生理盐水稀释,制成细菌悬浮液。应用API50CH和API20E细菌鉴定试剂盒(BioMerieux公司生产)对NCD-2菌株进行鉴定。对所获有关鉴定细菌的多个生理生化性状,通过BioMerieux公司提供的鉴定软件与档案资料对比分析,得出结论。2结果与分析2.1ncd-2的病情指数1999年～2000年,经过2年的田间小区试验,结果表明,NCD-2处理的病情指数显著低于空白对照,防病效果分别为78.1%和92.6%,平均为85.4%;同时,NCD-2处理的病情指数显著低于对照药剂PROTUSue617WG,表明NCD-2的防病效果优于对照药剂PROTUSue617WG(表1)。该结果说明,NCD-2是一株防治棉花黄萎病的有效菌株。2.2ncd-2药剂防治2.2.1育苗移栽栽培方式中NCD-2粉剂防病效果在棉花黄萎病发病高峰期(8月9日)调查各处理的病情,并于9月8日调查棉花单株结铃和密度(株/hm2)。结果表明,与空白对照相比,NCD-2处理极显著地降低了病情指数,防病效果为51.6%;同时显著提高了棉花产量,增产籽棉22.9%(表2)。2.2.2平播栽培方式中NCD-2粉剂防病效果2001年、2002年,先后在山东省宁津县、新疆进行了大区试验示范。在棉花黄萎病发病高峰期(山东8月30日;新疆8月25日)调查了病情。结果表明,NCD-2粉剂处理的病情指数极显著低于空白对照,防病效果分别为51.2%(山东)、60.6%(新疆)(表2)。2.2.3NCD-2粉剂处理对棉花考种性状的影响在2002年新疆大区示范中,对示范区的籽棉取样进行了室内考种。结果表明,NCD-2粉剂处理后,棉花的单铃重、衣分、衣指、籽指、绒长和不孕籽等性状均优于对照(表3)。2.3作物种子种薯的出苗本试验测定了NCD-2对小麦、玉米、棉花、马铃薯、黄瓜、茄子、大豆7种作物的安全性。结果表明,这7种作物的种子(种薯)在应用NCD-2粉剂拌种后,各处理的出苗率与相应空白对照差异不显著,说明该菌剂对这7种作物种子(种薯)的出苗没有不良影响(表4)。同时应用制剂拌种和制剂水悬浮液喷雾处理小苗后,作物的苗相正常,也没有出现发病植株。因此,生防细菌NCD-2粉剂对这7种作物是安全的。2.4cd-2的生化鉴定通过API50CH和API20E鉴定试验,获得了NCD-2菌株的61个生化性状,应用BioMerieux公司提供的鉴定软件与档案资料进行对比分析,认为NCD-2属于BacillussubtilisCohn.。3空白对照间病情的影响黄萎病是棉花生产中最严重的病害之一,目前尚无有效的防治措施。“以菌防病”的生物防治方式由于其特殊而复杂的作用机制,被认为是棉花黄萎病最具有发展潜力的防治方法之一,获得高效拮抗菌则是生物防治的基础。田间小区试验和大区示范结果均表明,NCD-2是一株对棉花黄萎病防治有效的细菌菌株。在连续2年田间小区试验中,NCD-2防病效果表现一定差异(相差14.5%)。分析造成这一差异的原因,我们可以看到试验中空白对照的病情指数年度间也存在较大的差异(相差38.1),而2年中NCD-2处理的病情指数又相差不大,这一结果说明空白对照间的病情严重程度是影响NCD-2防病效果年度间差异的直接原因。影响棉花黄萎病严重程度的主要原因是由于土壤中棉花黄萎病病原菌的变化,马平等和杨家荣等都已证明土壤湿度和温度这两个环境因素是影响病原菌变化的主要因素。这些环境因素是否影响NCD-2的防病能力,需要进一步研究加以明确。微生物制剂田间释放对其它生物的影响是一个非常重要的问题。本文明确了NCD-2菌株对主要大田作物小麦、玉米、棉花、马铃薯、黄瓜、茄子、大豆7种作物的安全性,为这一生防细菌的生产应用提供了科学依据。细菌的分类鉴定是细菌研究的重要基础性工作之一。目前常用的鉴定方法主要包括:依靠细菌的形态特征和生理生化反应,并参照《伯杰氏细菌鉴定手册》进行鉴定的传统方法;利用传统方法开发出的细菌鉴定试剂盒和自动鉴定系统(Biolog);依据ELISA技术的鉴定方法