广州管圆线虫在不同螺源中的发育情况及对balbc小鼠和昆明鼠的毒力比较

广州管圆线虫在不同螺源中的发育情况及对balbc小鼠和昆明鼠的毒力比较

广州管虫病是一种由人类感染的寄生虫。广州管虫是其病原。广州管圆线虫是1933年由我国学者陈心陶在广州的家鼠肺部发现并命名的,属圆线虫目、后圆线虫科、后圆线虫亚科、管圆线虫属。成虫寄生在肺动脉血管内,幼虫侵入中枢神经系统可致嗜酸粒细胞增多性脑膜脑炎。广州管圆线虫的中间宿主主要为螺类和蛞蝓(俗名鼻涕虫),螺类常见的有褐云玛瑙螺、福寿螺。终宿主主要为啮齿动物尤其是鼠类,以褐家鼠和黑家鼠较多见,此外还有白腹巨鼠、黄毛鼠和屋顶鼠等。近年来,由于广州管圆线虫病的中间宿主褐云玛瑙螺和福寿螺的大量养殖及食用,导致广州管圆线虫病的播散,但尚无文献比较两种螺内广州管圆线虫Ⅲ期幼虫的毒力是否存在差异。BALB/c及昆明(KM)小鼠为常用实验动物,均可感染广州管圆线虫,但哪种小鼠对广州管圆线虫更易感少有报道。为寻找适合于实验室感染使用的螺及小鼠,更好地为有关广州管圆线虫的系列研究提供实验材料,本研究比较了两种小鼠及两种常见中间宿主螺对广州管圆线虫的感染特征。1材料和方法1.1小鼠、大鼠、sd大鼠实验动物12只6周龄(体重16~20g)雌性BALB/c小鼠,32只6周龄(体重26~30g)雌性昆明小鼠及3只体重250g左右雌性SD大鼠均购自中山大学实验动物中心。SD大鼠用于广州管圆线虫的实验室人工保种。1.2实验螺钉从本实验室养螺池中随机抽取20只重16~26g的褐云玛瑙螺和20只重8~12g福寿螺作为本次实验感染用螺。1.3小鼠感染期幼虫的方法及分组从本实验室感染螺中分离广州管圆线虫Ⅲ期幼虫,每只SD大鼠感染50条,2个月后取粪便检查,当粪便中能检测到Ⅰ期幼虫时,取大鼠粪便分别喂食褐云玛瑙螺与福寿螺(10g/d),连续7d。1个月后,将上述两组螺去壳、剁碎、消化(每1000ml消化液中含胰蛋白酶2g、盐酸7ml、蒸馏水993ml,37℃消化2h)、过滤、沉渣水洗2次后,10倍光镜下检查。Ⅲ期幼虫大小为(425~524)μm×(23~34)μm,Ⅱ期较之要小。按常规实验方法,经灌胃每小鼠感染Ⅲ期幼虫30条。12只BALB/c小鼠和32只昆明小鼠随机分组及处理如下:A组12只昆明小鼠,感染幼虫取于福寿螺;B组为BALB/c小鼠,感染幼虫来自于褐云玛瑙螺;C组12只昆明小鼠用取自于褐云玛瑙螺的幼虫灌胃;D组8只昆明小鼠作为无感染对照组。1.4测量大鼠体重和死亡每天检查小鼠,记录小鼠死亡时间及数量。记录实验小鼠感染前及解剖前(感染后23d)的体重,观察每只小鼠体重变化(不包括死亡小鼠)。1.5总蛋白和总ph的制备用乙醚麻醉处死小鼠后,断颈,以镊子逐渐剥离颅骨,将小鼠脑组织置于35mm玻璃平皿中,用1ml中性PBS冲洗脑室,所得液体收集于EP管中。5000r/min离心10min,取500μl上清在595nm波长光下用HITACHIU1100(日本)分光光度计作总蛋白检测。10μl脑脊液上清加入等量的SDS上样缓冲液中,在8%含1%明胶的聚丙烯酰胺凝胶中电泳,分离胶为4%普通聚丙烯酰胺凝胶,120V1h电泳后,将胶取下。2.5%TritonX100洗涤30min2次后,双蒸水洗涤2次,用pH7.8含1mmol/LCaCl2的0.1Mtris-HCl缓冲液,37℃孵育24h。考马斯亮蓝染色1h,用含40%甲醇及10%乙酸的脱色液脱色约30min,水洗后扫描,根据条带大小判断基质金属蛋白酶9(mmp-9)的活性。1.6大鼠脑中的昆虫记录将每个处死小鼠的颅脑组织浸泡于10ml中性PBS中,让幼虫自动溢出,10倍解剖镜下数活虫。1.7切片、脱蜡、去蜡小鼠脑组织在4%多聚甲醛中浸泡固定24h后,50%、75%及100%乙醇脱水,二甲苯透明,55℃石蜡包埋24h,4μm厚度组织切片。每块切片65℃5min加热除去蜡块,二甲苯漂洗脱蜡5min3次,随后在100%、95%及75%乙醇中水化各5min,最后用三蒸水洗涤。伊红美蓝染色,光镜下观察病理改变。1.8统计分析死亡率、感染率及幼虫比率采用卡方检验,其他指标采用多重均数的秩和检验法,P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1表1表2表2存活褐云玛瑙螺及福寿螺均找到幼虫(表1)。两种螺内Ⅲ期幼虫的比率及螺的死亡率差异无统计学意义,但褐云玛瑙螺的幼虫数高于福寿螺(表1)。2.2感染小鼠血清学指标检测33.33%的BALB/c小鼠感染广州管圆线虫后出现死亡,但昆明鼠全部存活。感染小鼠均有不同程度的脑脊液蛋白增高(表2),脑内查到Ⅳ期或Ⅴ期幼虫。不同感染来源的两组昆明小鼠相比,这些指标差异均无统计学意义(P>0.05),而BALB/c小鼠脑内虫体数及脑脊液中蛋白量高于感染昆明小鼠(P<0.05)。2.3大鼠mgp-9活性试验的结果感染小鼠均出现mmp-9活性增强,但以BALB/c组小鼠最明显(图1)。2.4大鼠的体重改变感染BALB/c小鼠体重下降;感染昆明鼠体重上升,且感染昆明鼠体重变化与对照组相比差异无统计学意义(图2)。2.5大鼠脑组织病理学的结果组织病理学检查可发现感染小鼠脑部特别是脑膜出现炎症反应、嗜酸粒细胞侵入甚至出现红细胞(图3),但以BALB/c小鼠最为严重。3不同大小褐云玛瑙螺感染广州管圆线虫的环保意义福寿螺及褐云玛瑙螺为实验室常用的广州管圆线虫感染用螺。有报道称东方圆田螺及铜锈环棱螺也可感染,但东方圆田螺虫密度低于福寿螺及褐云玛瑙螺,而褐云玛瑙螺的相容性最好。我们的实验也证明福寿螺及褐云玛瑙螺均为易感螺;经比较来源于不同螺类的虫株其致病力无显著性差异,虫体的发育也无差异。广州管圆线虫存在不同的地理株,但来自于不同宿主的虫株暂未发现基因差异(结果未公布),所以宿主对虫株的影响可能不太明显。相对而言,每只褐云玛瑙螺可携带较单只福寿螺更多的幼虫,这可能与褐云玛瑙螺体重及体积更大有关。福寿螺繁殖快,成熟期短,但需频繁换水,这不仅增加了水的消耗,而且螺卵及幼螺也可能随水流出,导致环境污染。而褐云玛瑙螺为陆生螺,只要注意饲喂,从环保角度看,褐云玛瑙螺较福寿螺更适合于实验室使用。mmp-9活性、组织病理变化、脑内虫体数、脑脊液总蛋白含量等指标常用于衡量广州管圆线虫的病变程度;体重减轻及死亡率是衡量感染动物病变程度的公认指标。本实验表明,来源于福寿螺和褐云玛瑙螺的广州管圆线虫Ⅲ期幼虫毒力无明显差异,两组感染昆明小鼠mmp-9活性、死亡率、脑内虫体数、脑脊液总蛋白含量、体重变化与脑组织病理变化均未显示出差异。不同的寄生虫有其合适的宿主,敏感的动物模型对人体寄生虫的治疗、预防与诊断的研究都是非常重要的。小鼠是广州管园线虫常见的动物模型,从我们的实验结果来看,昆明小鼠对广州管圆线虫的感染不如BALB/c小鼠敏感,BALB/c小鼠各项病理指标较昆明鼠更明显,因而与昆明鼠比较BALB/c小鼠更适合于做广州管圆线虫的感染模型。有文章报道,家兔及豚鼠也为广州管圆线虫的非适宜宿主,但同期的小样本实验中感染的家兔及豚鼠均未在脑内检获幼虫,家兔及豚鼠是否