杨博实验报告

北京师范大学化学学院化学综合实验实验报告课程名称：以α-胰凝乳蛋白酶为催化剂在有机溶剂中合成N-保护的亮-脑啡肽三肽片段实验时间：____2014.9.27—2014.10.31__实验地点：基础化学实验中心化学综合实验室专业年级：________2012级2班学生姓名：_____________杨博___________学号：___________201211151808______指导老师：____________邢国文______________以α-胰凝乳蛋白酶为催化剂在有机溶剂中合成N-保护的亮-脑啡肽三肽片段杨博北京师范大学化学学院北京100875摘要：推荐一个面向理科高年级本科的化学生物学综合实验。以二氯甲烷为溶剂，使用α-胰凝乳蛋白酶为催化剂合成N-保护的亮-脑啡肽三肽片段。关键词：综合实验化学生物学酶促合成亮-脑啡肽α-胰凝乳蛋白酶实验目的：在做实验的同时开阔视野，了解一些近年来学科交叉研究领域的研究热点；熟悉一些化学生物学实验的基本实验方法与技巧，为今后的进一步科研深造奠定坚实的实验基础；通过本课程的训练，有效的提高独立科研能力和科研创新能力。实验原理：本实验以酪氨酸（Tyr）、双甘肽（Gly-Gly）为起始原料，经过四步反应得到了N-保护的亮-脑啡肽前三肽Z-Tyr-Gly-Gly-OEt。1、酪氨酸在氯化亚砜的作用下酯化，得到酪氨酸乙酯盐酸盐（HCl·Tyr-OEt）；2、酪氨酸乙酯与苄氧羰酰氯（Z-Cl）在碱性条件下反应，得到苄氧羰酰酪氨酸乙酯（Z-Tyr-OEt）；3、Gly-Gly在氯化亚砜作用下酯化，得到甘胺酰甘氨酸乙酯盐酸盐（HCl·Gly-GLy-OEt）；4、Z-Tyr-OEt与Gly-GLy-OEt在二氯甲烷中以α-胰乳蛋白酶催化得到亮-脑啡肽的前三肽，即N-保护的苄氧羰酰酪氨酰甘胺酰甘氨酸乙酯（Z-Tyr-Gly-GLy-OEt）。实验药品：药品名形状MWnDdmp/°Cbp/°C溶解性水乙醇乙醚乙醇无色液体461.36140.79-117.378.5易溶易溶易溶氯化亚砜淡黄色发烟液体118.96\1.64-10578.8分解易溶易溶Gly-Gly白色叶状结晶或片状晶体，有光泽132.12\\262\溶难不Tyr白色结晶粉末181.20\1.456342\难不不乙醚无色透明液体74.121.350.7134-116.334.6微溶溶HCl-Tyr-OEt白色结晶245.7\\\\溶溶溶HCl·Gly-GLy-OEt白色结晶196.6\\\\溶溶溶乙酸乙酯无色液体88.111.37190.902-83.677.2溶溶溶碳酸氢钾白色晶体100.12\\\\溶不不苯甲醇无色液体108.131.53961.0419-15.3205.7溶易易苄氧羰酰氯无色有刺激性气味的液体170.5\\\\分解溶溶硫酸镁白色粉末120\2.66\112.4溶微不石油醚无色透明液体\\0.64～0.66\40～80不溶溶Z-Tyr-OEt白色晶体343\\\\\\\Z-Tyr-Gly-Gly-OEt白色晶体449.1\\\\\\\三乙胺无色油状液体，有强烈氨臭101.191.40100.726-114.889.5微溶溶丙酮无色液体58.080.78451.3588-94.756.05溶溶溶实验步骤：实验步骤实验现象及解释（1）、HCl·Tyr-OEt的合成取8Ml无水乙醇，用冰盐浴冷至-10℃，缓慢加入2Ml氯化亚砜，加完后继续搅拌20min。加入Tyr1.0g，先初步摇匀，放入磁子，用磁力搅拌器室温搅拌3天。用旋转蒸发仪减压除去溶剂得到白色固体。用乙醇-乙醚重结晶：先用3mL乙醇微热，将固体溶解；在逐步加入乙醚，刚开始一段时间没有晶体析出，用玻璃棒摩擦瓶壁，很快析出大量白色结晶。无水乙醇用冰盐浴冷却到-10℃:氯化亚砜在受热和有水的条件下易分解。加入酪氨酸后搅拌：酪氨酸不溶于乙醇，所以该反应体系为非均相体系，只有通过搅拌，才能使反应充分进行。采取乙醇-乙醚重结晶：HCl·Tyr-OEt在乙醇中的溶解度大，可以完全溶解，而乙醚是HCl·Tyr-OEt的不良溶剂，通过自由扩撒，在乙醚中结晶析出。实验现象：实验过程中产生大量有刺激性气味的气体，得到白色的结晶。（2）、Z-Tyr-OEt的合成：将HCl·Tyr-OEt0.7g悬浮于14.2mL乙酸乙酯中，加入KHCO31.7g的11.4mL水溶液，冰浴下快速搅拌，15min内滴加Z-Cl的苯甲醇溶液0.61Ml。加完后搅拌20min，撤去冰浴，室温再搅拌2-3h。反应结束后用4mol/L的盐酸酸化，使水相的pH为1，分出有机相，用水、饱和食盐水洗涤，硫酸镁干燥。减压蒸除溶剂后，得到黄色油状物，置于冰水中，缓慢结晶，过滤得第一批晶体；在母液中加入缓慢加入石油醚再结晶得第二批晶体，共得产物称重。使用KHCO3调节pH至碱性，使苄氧羰酰氯与Tyr-OEt反应，生成-Tyr-OEt从而保护氨基；搅拌的目的:该体系是两相体系，充分搅拌，可以使两相充分接触，调节pH约为9，使氨基游离，而有利于亲核反应的进行。调节pH为1，使酚羟基游离，从而产物分布在有机相中，便于后续的分离提纯。母液中加入石油醚再次结晶，是因为石油醚是不良溶剂，Z-Tyr-OEt在其中的溶解度小于在母液中的，所以结晶析出。得产物0.41g（3）、以α-胰凝乳蛋白酶合成Z-Tyr-Gly-Gly-OEt。取0.3gZ-Tyr-OEt与HCl·Gly-GLy-OEt246ml悬浮于4mL二氯甲烷中，加入三乙胺0.246mL并在搅拌使底物完全溶解；调节pH值约为10，反应液为均一透明溶液；加入α-胰凝乳蛋白酶5mg和用注射器加入38。6uL水。室温下搅拌反应1-2天，反应液中有白色沉淀产生。反应3天后，测反应后体系的pH，将反应液过滤，滤饼依次用二氯甲烷、1mol/L盐酸、去离子水洗涤。在红外灯下烘干产物。使用丙酮-水重结晶。二氯甲烷：为有机相但以二氯甲烷作为有机相,应用相转移法,则肽键的形成得率较高；三乙胺：可溶于有机相中，调节pH至酶促反应的最适pH。水：酶促反应必须在有水的条件下才能进行，酶的活性与水的含量有关。非均相体系，需不断搅拌，且产率与搅拌速度有关。产物较少，只有瓶壁上有少许附着。pH=8，反应过程中pH降低。该步骤失败，产物不能溶解于丙酮中。实验数据记录与处理：（2）HCl·Tyr-OEt的产率：MTyr=181.2g/mol,mTyr=1g,MHCl·Tyr-OEt=245.7g/molM理论=mTyr/MTyr×MHCl·Tyr-OEt=1.36g，m=1.03gw=m/M理论×100%=75.6%;（3）Z-Tyr-OEt的产率：MZ-Tyr-OEt=343g/mol，MHCl·Tyr-OEt=245.7g/mol,mHCl·Tyr-OEt=0.7g,M理论=0.965g,mZ-Tyr-OEt=0.89gw=m/M理论×100%=92.3%,（4）Z-Tyr-Gly-Gly-OEt的产率：mZ-Tyr-OEt=0.09gm理论=mZ-Tyr-OEt/MZ-Tyr-OEt×MZ-Tyr-Gly-Gly-OEt=0.2gw=m/M理论×100%=45%实验思考与讨论：一、实验思考：混合溶剂重结晶：原理：某种有机物在某溶剂中溶解度很好时，先用最少量的该溶剂加热溶解，再加入溶解度稍差的另一种溶剂，降低该有机物的溶解度，然后降温析出晶体。混合溶剂重结晶步骤：按照选择溶剂的方法，试出混合溶剂各自量的比例将被重结晶物质加热溶解于适量的易溶溶剂中趁热过滤，以除去不溶性杂质用滴管逐滴加入热的不易溶的溶剂，直至出现浑浊，且不再消失为止再加热使其澄清，若不澄清，可再加较少量的易溶溶剂，使其刚好澄清将此热溶液在室温下放置，冷却析出晶体2、冰盐浴：冰盐浴的降温原理与溶液的凝固点下降有关。当食盐和冰均匀地混合在一起时，冰因吸收环境热量稍有融化变成水，食盐遇水而溶解，使表面水形成了浓盐溶液。由于浓盐溶液的冰点较纯水低，而此时体系中为浓盐溶液和冰共存，因此体系的温度必须下降才能维持这一共存状态（浓盐溶液和冰的共存温度应该比纯水的冰点更低）。这将导致更多的冰融化变成水来稀释浓盐溶液，在融化过程中因大量吸热而使体系温度降低。一般能降到-20℃。3、氯化亚砜：遇水遇热易分解：SOCl2+2H2O===H20+SO2+2HCl在HCl·Gly-GLy-OEt、HCl·Tyr-OEt合成中的作用：作为氯化剂；使成酯反应更易进行，与一般酯化不同的是，在氯化亚砜的作用下，酯基中的两个氧原子都来自于羧基。4、影响有机溶剂中酶促反应的因素：酶在各种有机溶剂体系中表现出来的催化性质(包括酶的活性、稳定性及专一性)相差甚远,主要取决于反应体系中水的含量和所选用的溶剂。溶剂的影响：溶剂对酶的影响体现在其对酶的蛋白质结构、分子柔性以及活性中心的作用。α-胰凝乳蛋白酶在有机溶剂中具有较高的稳定性；水的影响：水的含量：微量的水对酶在有机介质中的活性影响很大。酶在完全干燥的溶剂体系里基本上是不显催化能力的,但是其活力会随着体系里水含量的增加而明显加速。是因为水的加入使酶活性中心的极性和结构柔性大大提高在无水的状态下,酶分子的带电基团和部分极性基团相互作用使酶分子形成一种非活性的刚性结构。水的作用就是充当润滑剂,与这些功能团形成氢键，以降低蛋白质多肽链折叠结构内带电基团之间的静电作用和极性基团之间的偶极—偶极相互作用，从而提高蛋白质结构的柔韧性和极化性，增加酶的水合作用比选用不同溶剂对酶的活性和结构柔韧性的改变影响更大。另一方面,过多的水分又会使酶活性下降,因为酶的多种失活过程离不开水的参与,而且水分过多会促使酶分子聚集成团以影响底物和产物的扩散,或者使酶活性中心内部生成水簇,从而改变酶的结构并最终导致酶活性的下降。因此,掌握最佳水量可以使酶在溶剂体系中达到最佳的活性表达。水溶液的pH值：α-胰凝乳蛋白酶在pH=10.0的缓冲液中的稳定性最高,在pH=5.0的缓冲液中其次,在pH=7.0的缓冲液中最低。二、实验结果讨论： 实验（2）：产率只有75.6%，偏低，原因分析：乙醇的冷却的时间不够，