电穿孔技术制备b7-2重组bcg及其对膀胱癌细胞的作用

电穿孔技术制备b7-2重组bcg及其对膀胱癌细胞的作用

在膀胱内注入野生动物bcg，以预防膀胱肿瘤复发，治疗前位癌和术后剩余肿瘤。但仍有部分患者对其治疗无反应,而且野生型BCG可能产生严重的毒副反应。我们应用电穿孔法将表达人共刺激分子B7-2的穿梭质粒转入BCG,并鉴定了所得到的重组BCG所表达B7-2的情况、免疫学活性和抗肿瘤作用。现报告如下。材料和方法一、试剂和试剂盒野生BCG购自北京生物制品研究所,丹麦Ⅰ型。重组pYL-hB7-2(IgC+IgV)质粒为天津市泌尿外科研究所构建。电转化仪GenepulserxcellTM购自美国Bio-rad公司。ELISA-hB7-2试剂盒购自法国DIACLONE公司。乳酸脱氢酶试剂盒购自中生北控生物科技股份有限公司。培养基Middlebrook7H9Broth和7H10Agar购自美国DIFCO公司。二、g混合培养基将对数生长期的野生型BCG制成2ml感受态细菌后,与纯化的重组pYL-hB7-2(IgC+IgV)质粒60μg混合后电转。涂布于含有卡那霉素的Middlebrook7H10培养皿内,4周开始出现少量散在的乳白色菌落,挑取单个菌落在含有卡那霉素的Middlebrook7H9液体培养基中扩增。菌体洗涤后煮沸作为模板,根据人B7-2(IgC+IgV)序列和pYL质粒多克隆位点两端序列设计的2对引物进行PCR后切胶回收测序,根据结果筛选阳性菌落。三、培养抗菌剂野生及重组BCG分别接种到Middlebrook7H9培养基,补加ADC(牛血清白蛋白,葡萄糖和盐一定比例的混合液),振荡培养,7d传一代,选取对数生长期的菌液。野生型BCG与重组BCG菌液经稀释后涂布于含有卡那霉素的Middlebrook7H10培养皿内,4周计平皿菌落数。菌液经抗酸染色并在1000倍光学显微镜下观察。利用SDS和ELISA法测定吸光度600nm重组BCG上清液中和经超声破碎后菌体内B7-2蛋白,重组BCG连续传10代后再次测定。四、t细胞毒性测定采集20例健康成人外周血5ml,人外周血单个核细胞(PBMCs)经RPMI1640洗涤,调整细胞浓度至1×107/ml。实验分4组:①T淋巴细胞组:T淋巴细胞100μl,RPMI-164027μl;②野生型BCG组:T淋巴细胞100μl,野生BCG3μl,野生型BCG上清液20μl,RPMI-16404μl;③重组BCG组:T淋巴细胞100μl,野生BCG3μl,重组BCG上清液20μl,RPMI-16404μl;④抗体阻断组:T淋巴细胞100μl,野生BCG3μl,重组BCG上清液20μl,抗CD86单抗4μl。常规培养2h去掉贴壁的单核细胞,取未贴壁的淋巴细胞加入96孔细胞培养板,100μl(约1×106)/孔,并加入上述相应组分,饱和湿度条件下培养6h和72h,MTT检测后计算淋巴细胞的增殖倍数。五、重组bcg激活的细胞的培养按照乳酸脱氢酶试剂盒中说明配制溶液。效应细胞为分别激活的实验组和对照组的淋巴细胞,靶细胞为人EJ膀胱癌细胞,效靶比例为50∶1。实验分5组:①自然释放组:0.1ml培养液+0.1ml靶细胞;②最大释放组:0.1ml10%TritonX-100+0.1ml靶细胞;③单纯淋巴细胞组:0.1ml未经刺激的淋巴细胞+0.1ml靶细胞;④实验组:0.1ml重组BCG激活的淋巴细胞+0.1ml靶细胞;⑤对照组:0.1ml野生BCG激活的淋巴细胞+0.1ml靶细胞。均加入96孔培养板中后混匀,温箱中孵育;分别用紫外分光仪在340nm波长下读取各孔吸光度,每项指标均作3孔平行测定取均值,计算淋巴细胞的杀伤活性。对b7-2免疫后细胞的作用构建成功的重组BCG具有卡那霉素抗性,两次PCR产物经电泳后出现相应大小的条带,测序证实含有人B7-2cDNA。野生型BCG与重组BCG生长曲线未见明显差异。抗酸染色均为阳性,但重组BCG较野生型BCG菌体成比例稍微增大,仍为分枝状相互连接,连续传代10次后结果相似。600nm野生型和重组型BCG菌液中含有的活菌数分别为2.8×107CFU和2.7×107CFU。SDS可见重组BCG上清液中相应29000的蛋白条带含量增加。600nm重组BCG上清液中B7-2含量平均为3.8U/ml,菌体内为10.5U/ml,连续传10代后含量分别为3.9U/ml和10.2U/ml,与第一代重组BCG基本相同,而野生型BCG不表达目的蛋白。T淋巴细胞增殖倍数:6h后野生BCG组为1.202±0.320,重组BCG组为1.618±0.323,抗体阻断组为1.181±0.363;72h后分别为2.332±0.514,3.109±0.676和1.980±0.435。结果表明在野生型BCG模拟T细胞活化第一信号的情况下,所培养的淋巴细胞于培养6～72h不断增殖,野生型BCG对单纯T细胞具有一定的刺激作用;当加入的表达的目的蛋白B7-2分子作为共刺激信号协同作用后,T淋巴细胞增殖倍数提高了34.8%。在抗体阻断实验中,特异性抗人B7-2单克隆抗体明显抑制目的蛋白的促增殖作用,表明重组BCG对T细胞增殖作用的增强主要是由其表达的共刺激分子引起。杀伤实验的吸光度变化量(△A值)各组依次为0.193、0.382、0.208、0.295和0.243。未经刺激的淋巴细胞杀伤活性为7.5%,野生BCG组为25.2%,重组BCG组为53.9%。结果显示分泌B7-2的重组BCG激活的淋巴细胞杀伤活性是单纯淋巴细胞的7.2倍,是野生BCG的2.1倍。共刺激分子b7-2和bcg对t细胞的激活作用利用基因工程技术构建的具有分泌功能的重组BCG在抗肿瘤方面已经进行了一些研究,重组BCG通过高效表达IL-2、TNF、IFN-γ等细胞因子加强BCG介导的细胞毒活性,促进T细胞等对肿瘤的杀伤作用,效果远高于单独使用BCG的效果。我们采用的大肠杆菌-分支杆菌穿梭表达质粒,是近年的第3代大肠杆菌-分枝杆菌穿梭载体,不仅含有能表达外源基因的启动子hsp60,而且在启动子下游克隆了一段BCG主要分泌性抗原Ag85-B的信号肽序列,该序列能指导外源基因在分支杆菌中分泌性表达,使重组BCG能将目的蛋白B7-2分泌性表达到BCG外,从而最大程度发挥其作用。在机体抗肿瘤起主要作用的细胞免疫需要共刺激信号来激发,缺乏共刺激因子是肿瘤免疫逃避的重要机制之一。在抗原提呈细胞活化时,共刺激分子B7-2表达于反应早期,被激活后表达增加,因此在免疫应答的启动决定时起是否发生的作用。实验已证实单纯的B7胞外功能区所表达的蛋白就具有激活T细胞的能力,即B7胞外功能区具有与完整B7分子相同的共刺激作用。本实验采用人B7-2的胞外功能区(IgC+IgV)作为目的蛋白,在原核表达载体BCG中来表达,结果在SDS上可看到目的蛋白出现在相应位置,ELISA也证实重组BCG内外均有目的蛋白表达。分泌到上清液的浓度较菌体内低可能与BCG较厚的菌壁结构有关。另外通过对抗酸染色、分枝状相连接和生长曲线的观察,结果发现在质粒转入和表达蛋白后,重组BCG与野生型BCG没有出现显著性差异,而且连续传代10次后具有遗传稳定性。虽然原核表达系统BCG已经分泌出目的蛋白,但其是否具有生物学活性是本研究的重点。我们用野生型BCG模拟T淋巴细胞活化的第一信号,加入的目的蛋白B7-2分子功能区作为第二信号协同刺激T淋巴细胞增殖,可以发现较野生型BCG的增殖活性更强,说明B7-2分子对淋巴细胞起到了共刺激作用,促进增殖;另外在抗体阻断实验中,特异性抗人B7-2单克隆抗体明显抑制目的蛋白的促增殖作用,表明重组BCG对T细胞的刺激作用主要由其表达的共刺激分子B7-2引起。进一步实验也发现在双重信号的共同作用下淋巴细胞不仅表现为细胞数目的增殖,对肿瘤细胞的杀伤作用也较野生型增