-谷甾醇对胃癌sgc-7501细胞杀伤作用机制的研究

-谷甾醇对胃癌sgc-7501细胞杀伤作用机制的研究

近年来，消化系肿瘤的发病率逐渐增加，治疗主要以手术和放疗为主。然而，晚期肿瘤患者失去了手术的机会，无法承受放疗和放疗的强烈毒副作用。因此，提高患者的生存率和生活质量已成为治疗的重点。随着肿瘤免疫学的发展,肿瘤过继免疫治疗成为目前肿瘤治疗的热点。应用多种细胞因子和刺激分子联合诱导培养的人PBMC(共刺激细胞)是具有高度杀伤活性的免疫效应细胞,刘军权等报告,共刺激细胞对胃癌细胞SGC-7901、胰腺癌细胞SW-1990、结肠癌细胞SW-1116、人肺癌细胞株A549、乳腺癌细胞株MFC-7和人黑素瘤细胞株HME1杀伤活性明显高于CIK细胞。β-谷甾醇(β-sitosterol)为植物甾醇类成分,存在于各种植物油、坚果等植物种子中,相关研究表明β-谷甾醇具有降低血清胆固醇、消炎解热、抗肿瘤及提高机体免疫力等作用。并已证明β-谷甾醇可诱导结肠癌、前列腺癌和乳腺癌细胞的凋亡。为了解β-谷甾醇对免疫细胞的影响,我们将不同质量浓度的β-谷甾醇在体外作用于共刺激细胞,以探讨β-谷甾醇对人共刺激细胞杀伤SGC-7901细胞的影响极其可能的机制,以期为β-谷甾醇用于肿瘤的治疗提供理论依据和实验依据。1材料和方法1.1免疫、生化药物和仪器β-谷甾醇(含量>98%,本实验室制备);四甲基偶唑蓝(MTT)、二甲亚砜(DMSO)均购自Sigma公司;CellCountingKit-8(CCK8)购自碧云天生物技术研究所;人胃癌SGC-7901细胞株购自中国科学院上海细胞研究所;RPMI1640培养基、小牛血清、胰蛋白酶均购自Gibco公司;淋巴细胞分离液(中国科学院血液病研究所);IL-1α、IL-2、IL-18(厦门特宝生物公司);IL-15和IL-21(购自R&D公司);CD3单抗(上海免疫研究所);CD28单抗(苏州大学生物技术研究所);INF-γ购于Abender公司;FITC和PerCP标记的抗人CD3、PE标记的穿孔素、颗粒酶B和APC标记的CD107a抗体,Fix&Perm破膜剂均购自杭州联科生物公司(Immunotech,Franc);鼠抗人pERK1/2单克隆抗体,兔抗人Bcl-2单克隆抗体均购自santacruz公司;乳酸脱氢酶试剂盒(日本世诺临床诊断制品株式会社);BCA蛋白质量浓度测定试剂盒(碧云天生物技术研究所);Encore全自动生化分析仪(购自北京希亚克技术有限公司);流式细胞仪(美国BD公司);ABXpentra120全自动5分类血液分析仪(法国ABX公司)。1.2重组细胞的制备取10份健康献血者外周抗凝血,10ml/每份,用淋巴细胞分离液分离单个核细胞(1500r/min,离心15min),吸取单个核细胞层,生理盐水洗涤3次(1500r/min离心,10min/次),用RPMIl640培养液(含rhIFN-γ2×106U/L、100ml/L小牛血清、50ml/L人AB血清)调整细胞数为5×108/L,接种于6孔细胞培养板中,每孔5ml,置37℃、5%CO2环境培养24h,然后加入IL-1α(10μg/L)、rhIL-2(5×104U/L)、CD3mAb(1mg/L)、IL-15(20μg/L)、IL-18(10μg/L)、IL-21(10μg/L)、CD28mAb(10mg/L),于37℃、5%CO2培养箱中培养,每2天半量换培养基(含相应的细胞因子)1次,并调整细胞数为5×108/L。收集培养10d的贴壁细胞进行细胞表面标志物检测和相关实验。1.3细胞培养和分离将复苏后的胃癌SGC-7901细胞放入细胞培养瓶中,加入10ml细胞培养液,在37℃、5%CO2条件下培养,2~3d更换细胞培养液,细胞铺满瓶底时,0.25%的胰酶消化脱壁,800r/min离心3min,弃去上清,收集细胞用于实验。1.5供标药物复孔取对数生长期SGC-7901细胞,配成5×108/L,接种于96孔板中,0.2ml/孔,于37℃、5%CO2培养箱中培养,24h后加入β-谷甾醇(终质量浓度分别为0.15、0.3、0.6、1.25、2.5、5、10、20、40、80μg/ml),设不加药物的对照组及空白对照,每组设5个复孔。继续培养48h后加入MTT20μl,置于37℃、5%CO2培养箱中继续孵育4h,弃去上清,每孔加入DMSO150μl,轻轻震荡10min,使沉淀产物完全溶解,在450nm波长酶标仪上测定各孔光吸收值(OD),求其平均值后计算细胞抑制率。1.6cd扩增因子tcd107a,gra-pes,cd113,pfp和ifn---2的检测收集培养10d的共刺激细胞接种于6孔细胞培养板中,加入β-谷甾醇(终质量浓度分别为0.15、0.6、2.5、10、40μg/ml),设不加药物的为对照组,每组设3个复孔,培养72h,收集细胞,PBS洗涤3次,调整细胞数至1×1010/L,加入3只离心管,每管100μl细胞悬液,加入PerCP-Cy5.5标记的CD3抗体和FITC标记的CD56抗体各20μl,室温避光孵育30min,PBS洗涤,加入100μl破膜剂A,室温避光孵育15min,PBS洗涤,加入100μl破膜剂B,同时分别在试管中加入anti-GraB-PE、anti-PFP-PE、anti-CD107a-APC和anti-IFN-γ-APC各5μl,设置同型对照抗体管,共同孵育15min,PBS洗涤,然后加入PBS500μl,流式细胞仪检测CD107a、GraB、PFP和IFN-γ的含量。每组实验重复3次,取平均值。1.7活性单位的测定按已建立的LDH释放法进行检测。将培养10d的共刺激细胞配成2×109/L的效应细胞,加入6孔板,每孔3ml,加入β-谷甾醇(终质量浓度分别为0.15、0.3、0.6、1.25、2.5、5、10、20、40μg/ml),设不加药物的为对照组,每组设3个复孔,继续培养72h,收集共刺激细胞作为效应细胞,取对数生长期的SGC-7901细胞,配成2×108/L的靶细胞,将效靶按10∶1比例混合,置于37℃、5%CO2培养箱中孵育6h后,1500r/min离心10min,收集上清液,全自动分析仪340nm波长下测定LDH的活性单位(U/L),杀伤活性=(测定管LDH单位-效应细胞自然释放LDH管)/(靶细胞最大释放LDH管-靶细胞自然释放LDH管)×100%。每检测样本设3个复管,重复3遍,取平均值。1.8凝胶电泳、转膜、封闭的制备β-谷甾醇(终质量浓度分别为0.15、0.6、2.5、10、40μg/ml)与共刺激细胞共同培养72h后,离心收集共刺激细胞,调整细胞数为5×108/L,PBS洗涤3次,2000r/min离心10min,弃上清,加入细胞裂解液500μl,冰浴30min,4℃,12000r/min离心10min,收集上清作为细胞总蛋白,BCA试剂盒测蛋白质量浓度,按100μg/孔上样,进行凝胶电泳、转膜、封闭。一抗、二抗孵育及显色,扫描条带,用ImageJ图像分析软件进行灰度值分析,以GAPDH为内参表示所测蛋白的相对表达强度。1.9统计学处理采用SPSS13.0软件进行统计学处理,计量资料使用均数±标准差表示,组间比较采用单因素方差分析(One-wayANOVA),检验水准α=0.05,P<0.05差异有统计学意义。2结果2.1fcm检测共刺激细胞表型cd3+cd65+表达体外培养10d后,共刺激细胞增殖能力明显增加,增殖倍数为251±5.8,FCM检测共刺激细胞表型CD3+CD56+表达由4.79%增加到38.47%,结果如图1。2.2它对刺激细胞和星形细胞的生长有影响。gsc-rt12.2.1谷哌醇对g/ml-谷哌醇共刺激细胞增殖率的影响质量浓度在0.15~10μg/ml时,β-谷甾醇促进共刺激细胞增殖,质量浓度大于20μg/ml时,共刺激细胞生长受抑制。统计分析显示:与对照组比较,质量浓度2.5~10μg/mlβ-谷甾醇作用24h后,共刺激细胞增殖率显著提高(P<0.05),质量浓度0.6~10μg/mlβ-谷甾醇作用48h后,共刺激细胞增殖率显著提高(P<0.05),质量浓度0.15~10μg/mlβ-谷甾醇作用72h后,共刺激细胞增殖率显著提高(P<0.05),24、48、72h质量浓度在5μg/ml时,增殖率达高峰。相同质量浓度的β-谷甾醇作用后,随着时间的延长,共刺激细胞的增殖率逐渐上升,72h达高峰,与24、48h组比较有统计学意义(P<0.05)(图2)。2.2.2不同质量浓度对1细胞生长的影响β-谷甾醇质量浓度在10~80μg/ml时对SGC-7901细胞的生长起明显的抑制作用,与对照组比较均具有统计学意义(P<0.05),且随着质量浓度的增加抑制率逐渐增大,3个时间段比较无明显统计学差异(图3)。2.3-谷哌醇对grab、ifn-表达的影响质量浓度为0.15~10μg/ml的β-谷甾醇与共刺激细胞共同培养72h后,共刺激细胞PFP、GraB、IFN-γ的表达率均明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),提示上述质量浓度的β-谷甾醇能够上调共刺激细胞PFP、GraB、IFN-γ的表达,当β-谷甾醇质量浓度为40μg/ml时,PFP的表达率低于对照组(P<0.05),提示高质量浓度的β-谷甾醇能够下调共刺激细胞的功能。共刺激细胞中CD107a的表达水平在β-谷甾醇作用前后无明显统计学意义(P>0.05),结果见表1、图4。2.4-谷哌醇对gc-711细胞的杀伤活性质量浓度为0.3~2.5μg/ml的β-谷甾醇作用72h后,共刺激细胞对胃癌SGC-7901细胞的杀伤活性随着β-谷甾醇质量浓度的增加而逐渐增强,质量浓度为2.5μg/ml时达高峰(59.24%),与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),当质量浓度超过2.5μg/ml时,杀伤活性开始下降,以上结果显示适当质量浓度的β-谷甾醇能够提高共刺激细胞对胃癌SGC-7901细胞的杀伤活性(图5)。2.5-谷哌醇作用后,2次给药后,52.0.5%p-erk1/2的表达β-谷甾醇作用72h后,共刺激细胞中p-ERK1/2、Bcl-2蛋白的表达如图6,灰度值分析结果显示:质量浓度0.15~2.5μg/ml的β-谷甾醇作用后的共刺激细胞p-ERK1/2表达高于对照组,质量浓度为40μg/ml时p-ERK1/2的表达显著高于对照组,2者与对照组比较有统计学意义(P<0.05);质量浓度0.15~40μg/ml的β-谷甾醇作用后共刺激细胞Bcl-2表达显著高于对照组(P<0.05),与对照组比较有统计学意义(P<0.05)(图6)。3cd8和cd2β-谷甾醇为植物甾醇类成分,主要存在于自然界中的各种植物油、坚果等植物种子中,因其具有低毒、较强的抗肿瘤活性,因此成为肿瘤治疗的主要药物成分。王莉等研究表明不同质量浓度的β-谷甾醇作用于宫颈癌细胞可抑制细胞的增殖。李庆勇等研究发现β-谷甾醇可能通过线粒体途径诱导人肝癌SMMC-7721细胞发生凋亡。本实验通过不同质量浓度的β-谷甾醇在体外诱导人共刺激细胞,结果发现β-谷甾醇质量浓度在0.15~10μg/ml范围时,可明显促进其增殖,当质量浓度为5μg/ml时,3个时间段细胞增殖率均达高峰,当β-谷甾醇质量浓度大于20μg/ml时,共刺激细胞的增殖出现明显的抑制,提示β-谷甾醇对共刺激细胞的增殖具有质量浓度窗现象。胃癌在肿瘤中致死率较高,我国是胃癌的高发国家,每年新发病例占全球的40%,治疗主要以手术、放化疗为主,但对于失去手术时机及不能耐受放化疗的患者,寻求新的治疗方法迫在眉睫。肿瘤免疫治疗是调动机体的免疫系统,增强肿瘤微环境的抗肿瘤能力,从而控制和杀伤肿瘤细胞的方法。共刺激细胞是在人外周血单个核细胞(PBMC)中添加多种细胞因子(IFN-γ、IL-1α、IL-2、IL-15、IL-18和IL-21)和刺激分子(CD3mAb、CD28mAb)共同培养的异质群免疫效应细胞,这群细胞高表达CD45RO+(记忆性T细胞)和CD3+CD56+(NK样T细胞)。培养体系中的IL-15能抑制T淋巴细胞的凋亡,并促进记忆性CD8+T细胞的存活。IL-21还能有效增强IL-15对前体T细胞的活化作用,增强细胞毒性T细胞的细胞毒活性并促其分泌IFN-γ,Williams等在体外对HIV患者外周血单个核细胞培养过程中发现,IL-21可以增加CD8+T淋巴细胞表达穿孔素。CD28是迄今为止公认的最基本的共刺激信号,其在降低T细胞活化及阻止T细胞失能等方面均具有重要作用。Vasir等研究表明,CD28可以增加T细胞的活化,促进T细胞IL-2生成和抗原特异性的T细胞的增殖。另外效应性T细胞经CD28抗体激发后大量活化增殖,FoxP3+Treg的比例相对下调,细胞的衰老表达明显减少。Paul等在进行人的PBMC培养体系中分别或联合加入CD3mAb、IL-2、IL-15和CD28mAb后发现,联合培养的免疫效应细胞增殖倍数和分泌的细胞因子IFN-γ明显高于单用CD3mAb、IL-2诱导培养的细胞(CD3AK细胞),其细胞CD45RO+和CD3+CD56+表型标记也高于CD3AK细胞;我们的研究结果显示,应用多种细胞因子和刺激分子联合培养的共刺激细胞结果与Paul等报道的结果类似。PFP是一种糖蛋白,能以钙离子依赖方式在靶细胞膜上形成穿孔素管状通道,进而导致靶细胞渗透性溶解破坏。GraB是具有天冬氨酸酶活性的丝氨酸蛋白酶,它能够通过caspase依赖途径、不依赖caspase的胞质途径及直接入核途径杀伤靶细胞。IFN-γ主要由活化的T细胞产生,具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用,在多种疾病和癌症中发挥作用。吴江雪等研究发现,IFN-γ对鼻咽癌细胞有抗肿瘤作用。本研究的FCM结果显示,质量浓度为0.15~10μg/ml的β-谷甾醇作用后,共刺激细胞表面的PFP、GraB、IFN-γ的表达率均明显高于对照组(P<0.05),提示上述质量浓度的β-谷甾醇能够上调细胞PFP、GraB、IFN-γ的表达,当β-谷甾醇质量浓度为40μg/ml时,PFP的表达率低于对照组(P<0.05),提示高质量浓度的β-谷甾醇能够下调共刺激细胞的功能。细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)是ERK家族的重要成员,其活化形式是磷酸化细胞外信号调节激酶(p-ERK),通常认为ERK磷酸化代表ras/raf/MAPK信号通路的活化。我们的实验研究发现,β-谷甾醇质量浓度在0.15~2.5μg/ml时,共刺激细胞中p-ERK1/2蛋白的表达量显著高于对照组(P<0.05),提示β-谷甾醇能够上调细胞中p-ERK1/2的表达,