基于is序列的侧耳属植物分类鉴定研究

基于is序列的侧耳属植物分类鉴定研究

侧耳p.k.kumm是一个与人类密切相关的重要经济真菌。世界上有20种（kirk等人，2008），对转化和环境恢复木材纤维的作用引起了广泛的关注（hadar等人，1993）。其中的糙皮侧耳Pleurotusostreatus(Jacq.)P.Kumm.是全球性栽培种类,其基因组测序工作已于2007年已启动。近200年来,侧耳属描述的分类单元超过1,000个(Guzmán2000),主要原因是子实体形态受环境条件影响大,按照形态特征分类导致较多的同物异名或同名异物。为了正确认识和科学利用侧耳属资源,其分类鉴定和系统发育研究得到广泛关注(Vilgalys&Sun1994;Bunyardetal.1996;Vilgalysetal.1996;Thornetal.2000;Moncalvoetal.2002;马富英和罗信昌2002;李雪玲和姚一建2004;郑和斌等2006;李翠新2007),但是,目前对侧耳属的分类鉴定和系统发育关系仍未完全明确。分子生物学和生物信息技术的发展,为侧耳属的鉴定和系统发育研究提供了诸多可供选择的技术方法。但是,使用传统分类方法命名的研究材料,甚至命名有误的材料,结果分析的错误便不可避免。其次,GenBank收录序列信息时缺乏对样品生物学物种的准确性审核,GenBank序列信息可靠性不足(Harris2003;Nilssonetal.2006;Brock2009)。这些不足导致了侧耳属的鉴定和系统发育研究结果更加混乱。另外,系统发育树重建的方法也是影响系统发育结果的重要因素之一。不同方法的可靠性和实用性依赖于数据的结构和大小,不同方法的优缺点引起激烈争论(Saitou1996;Swoffordetal.1996;Avise2004)。最大简约法(MaximumParsimony,MP)、距离矩阵邻接法(NeighborJoining,NJ)、最大似然法(MaximumLikelihood,ML)、最小进化法(MinimumEvolution,ME)和贝叶斯法(Bayesian)是生物系统发育树重建的主要方法。贝叶斯法能够根据分子进化的现有理论和模型用概率重建系统进化关系,克服ML法计算速度慢、不适用于大数据集样本的缺陷,并且贝叶斯法无需自引导法进行检验,以后验概率直观地表示分析结果,弥补了MP、NJ、ML和ME法的缺点,得到广泛的应用(Holder&Lewis2003)。本研究选择了经分类学专家生物学物种鉴定的侧耳属16种38个菌株为材料,测定(InternalTranscribedSpacer,ITS)序列,以全部自测数据分析侧耳属种间ITS趋异度;并以香菇Lentinulaedodes(Berk.)Pegler为外群,采用贝叶斯法构建系统发育树,以减少引用网上数据比对导致的误差,从而较全面地探讨侧耳属内的系统发育关系。1材料和方法1.1试验材料本研究所采用的侧耳属38个菌株,分属于16个种,其中包括全球主要栽培种类,供试材料及来源见表1。1.2提取的dna基因组总DNA采用CTAB法提取(Palumbi1996),0.8%的琼脂糖凝胶检测DNA样品质量和浓度。1.3pcr扩增反应选用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)(Whiteetal.1990)。PCR扩增反应在iCyclerThermalCycler上进行。反应体积为50µL,其中:1.25UExTaqDNA聚合酶(TaKaRa),1×ExTaqBuffer(Mg2+plus),0.2mmol/LdNTPs,引物ITS1和ITS4各0.4µmol/L,10-20ngDNA模板。扩增程序为:94℃预变性5min;然后94℃变性40s,58℃退火40s,72℃延伸60s,35个循环;最后72℃补平7min,4℃保存。扩增产物经1.4%的琼脂糖凝胶电泳检测。1.4柱式dna胶回收试剂盒采用PCR产物直接测序。对于未成功的,采用克隆后测序。PCR产物经UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒(Sangon)纯化,纯化后连接于pMD19-TVector(TaKaRa),纯化和克隆按试剂盒说明书操作。测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。测序结果经人工核对,提交GenBank。1.5行为分析计算公式1.2.根据Kelleretal.(2009)的方法查找ITS2序列。序列比对采用ClustalX2.0(Larkinetal.2007)。序列趋异度分析采用MEGA4(Tamuraetal.2007)。系统发育分析采用贝叶斯法,采用MrBayes3.1.2(Ronquist&Huelsenbeck2003)。系统进化树编辑采用Treeview1.6.6(Page1996)。2结果与分析2.1多样性位点分析当空位作缺失处理时,38个侧耳属菌株ITS序列排序后的长度为685位点,其中有296个多样性位点,占总位点数的43.21%。对ITS各个区域进行独立分析后发现,ITS1区域有161个多样性位点,5.8S区域有4个多样性位点,ITS2区域有130个多样性位点,28S区域41个位点中,1个多样性位点。2.2整株s-3-4和4.cysti分离的pcr-4.在侧耳属的16个种中,种内ITS趋异度较小。其中,P.djamor种内ITS的趋异度最大,仅为0.007。这应该与地理来源不同有关,3个菌株CBS100134、CBS665.85、ACCC51300分别来自巴新、荷兰、德国。P.eryngii种(含变种)内ITS趋异度为0.002,P.cystidiosus种(含变种)内ITS趋异度为0.001。在P.australis、P.cornucopiae、P.dryinus、P.nebrodensis、P.ostreatus、P.pulmonarius6个种的种内ITS序列完全相同。侧耳属16个种的种间ITS的趋异度中,P.rattenburyi和P.djamor之间ITS的趋异度最大,为0.282;P.ostreatus和P.cornucopiae的ITS趋异度最小为0.003。P.abieticola、P.cornucopiae、P.eryngii、P.nebrodensis、P.ostreatus和P.pulmonarius的种间趋异度为0.003-0.034。P.euosmus和P.citrinopileatus的ITS趋异度为0.022(表2)。2.3聚糖酸酯系、聚类和聚类分析由贝叶斯法构建的侧耳属系统发育关系树拓扑结构,部分节点的后验概率值为0.96-1.0,十分可靠,其余节点的后验概率值为0.61-0.87(图1)。同属于侧耳属Pleurotus亚属的P.abieticola、P.cornucopiae、P.eryngii、P.nebrodensis、P.ostreatus和P.pulmonarius6个种聚为一支,后验概率值为1.00,亲缘关系较近,其中P.eryngii和P.nebrodensis后验概率值为1.00,P.eryngii、P.nebrodensis、P.ostreatus和P.cornucopiae后验概率值为0.99。同属于侧耳属Coremiopleurotus亚属的P.australis、P.cystidiosus和P.smithii聚为一支,后验概率值为1.00。P.citrinopileatus和P.euosmus聚为一支,后验概率值为1.00。P.calyptratus和P.djamor聚为一支,后验概率值为0.99。其余节点后验概率值虽然超过0.6,但并未超过0.95。3讨论3.1系内近缘种鉴定自Gardesetal.(1991)利用ITS在真菌鉴定中成功应用之后,以ITS序列为基础的真菌鉴定被广泛应用(Gardes&Bruns1993;Brocketal.2009)。最常用的方式是以测序结果进行序列比对,在测序时常采用PCR产物直接测序,当直接测序失败后,采用克隆后测序。由于DNA聚合酶保真性不同,导致PCR扩增存在一定的错配(Kobayashietal.1999),克隆测序的结果并不能完全反映序列的真实结果;也有针对特定种设计特异引物,进行属内近缘种的鉴定(Amicuccietal.1998);也有使用ITS-RFLP进行分类鉴定(Gardes&Bruns1996;Yangetal.2007;Gurjaretal.2009);也有利用ITS2二级结构进行物种鉴定(Kruger&Gargas2008)。但是,ITS并未成为真菌的DNABarcoding。另外,真菌的ITS序列差异多少才界定为同种一直未有定论(Nilssonetal.2008)。Hughes&Petersen(2009)认为伞菌的ITS序列差异不超过2%-3%定为同种。本研究结果表明,利用ITS序列能够对于侧耳属的大多种类进行有效鉴定。而其中的P.cornucopiae与P.abieticola、P.eryngii、P.nebrodensis、P.ostreatus、P.pulmonarius的种间趋异度均小于0.02。P.eryngii与P.nebrodensis种间趋异度、P.ostreatus与P.pulmonarius种间趋异度也小于0.02。以ITS序列差异不超过2%-3%定为同种,并不合适。按照种间生殖隔离的生物学物种的界定原则,这6个是独立的生物学物种(Petersen&Ridley1996;Petersen&Hughes1997;Baoetal.2004)。其中的P.ostreatus和P.cornucopiae的ITS趋异度最小,仅为0.003,ITS序列难以对两者有效地区分,仍需开发新的分类鉴定标记。3.2侧耳属内系统发育分析系统发育的发生过程都是已经完成的历史,只能去推断或者评估,而无法再现。真菌由于形态特征较少、缺少可用的化石记录以及其丰富的多样性给系统发育研究带来更多的不便。本研究表明,利用贝叶斯法构建的侧耳属系统发育树,部分支点的后验概率值大于0.95,结果可靠,但是对于其他支点后验概率值仅为0.61-0.87。所以仅利用ITS序列,并不能准确反映侧耳属内系统发育关系。李雪玲和姚一建(2004)用28SrDNA构建侧耳属系统发育树、Gonzalez&Labarère(2000)用线粒体中核糖体小亚基rRNA的V4,V6和V9区序列构建的侧耳属内系统发育树的许多节点自展值小于70。Hillis&Bull(1993)和Kimballetal.(1999)认为系统发育树分支的自展