原油和油田产水中微生物群落结构的研究

原油和油田产水中微生物群落结构的研究

特别是在那些使用注水法提高原油产量的油田中，有一些厌氧微生物群落。这些细菌的来源,也就是说它们是本来存在于油田里的还是由注水引入的,目前还不能完全分辨出来。因为微生物会影响储存原油的质量,比如硫酸盐还原菌产生的硫化物具有毒性和腐蚀性,而且硫化物可能会生成不溶性的金属硫化物,这些不溶性的金属硫化物会造成油储层渗透率的损失。此外,一些微生物还有缺氧氧化石油烃的能力,这些因素都会对石油工业造成很大的损失。为了抑制油藏中的细菌活性,在石油生产中人为加入一些细菌抑制物质,这些物质包括:氧化性和非氧化性的杀菌剂(氯、溴、醛)以及季鏻盐类等。近期有文章称:通过在回注水中加入硝酸盐(或亚硝酸盐或硝酸盐亚硝酸盐的混合物)和引入硝酸盐还原菌、硫化物氧化菌的方法对抑制硫化物积累很有效。在石油工业中,很难估计由微生物(SRB和其他细菌)作用导致管道腐蚀而造成的经济损失。有研究者报道,当只用杀菌剂来控制微生物的活性时,每个井台用于控制SRB的活性每年大约需花费150000美元。所以,研究油田环境中的微生物群落分布和多样性非常重要。但是,迄今为止,对远距离石油集输系统中的微生物群落的研究存在空白。在石油微生物学中,也有应用分子生物学技术来分析油藏和油田中的微生物群落。但是,在这些研究中用于PCR扩增的DNA不是从原油样本直接提取得到的,所以16SrDNA扩增不能准确反映出石油中的微生物群落的特点。Tanaka等报道,硫酸盐还原菌的16SrDNA可以从原油样本中直接扩增。本文对中国长庆陕北油田石油集输系统中原油样本和采油污水样本中的微生物群落结构进行系统分析,所得结果对我们进一步了解并控制石油污染源以及管线微生物腐蚀等具有重要的价值。1材料和方法1.1样品的采集和处理样本及取样点分别从油井井口、石油计量站和石油综合处理站同时采集原油和水样。这些采样点属于中国长庆油田(陕北)的同一石油集输系统。从油井到石油计量站的距离为13.2km,从石油计量站到石油综合处理站的距离为25.6km。从油井中取油水混合样品,将其静置30min,取上层作为原油样本,下层作为水样。从石油计量站的油水重力分离器中收集原油样本和水样。石油综合处理站的原油样本和水样分别取自储油罐和污水罐。将这些样本在4℃其下存储以供分析之用。1.2方法1.2.1样品的提取和浓缩根据Nobuyuki等人的方法,用2,2,4-三甲基戊烷(异辛烷)(中国上海化学试剂厂)来处理原油样本。将200mL原油加入到同等体积的异辛烷中,振荡混匀,并在4℃下8000r/min离心20min。在离心后的沉淀物中加入等量的异辛烷,依照上述方法再进行混合,离心。沉淀物悬浮在约10mL的异辛烷中,这些悬浮液可直接用来提取DNA。用土壤DNA快速提取试剂盒(Bio101;Carlsbad,CA,USA),按照说明来提取DNA。把样品适当稀释,将试剂盒中提供的MT缓冲溶液加入同等体积到200μL的稀释液中。用玻璃珠搅拌器(Mini-BeadBeater;BiospecProducts,Bartlesville,OK,USA),在3800r/min的速度下搅拌30s。进行6次同样的DNA提取操作后,获得50μL的DNA溶液。用0.8μm的微孔过滤器(AdvantecToyoKaisha,Tokyo)过滤200mL的油田产水,再用0.45μm的微孔过滤器(AdvantecToyo)将滤液浓缩至约1mL。取450μL的浓缩菌液来提取细菌DNA。1.2.2pcr扩增和转染采用以下引物对真细菌16SrDNA片段进行PCR扩增:341F(5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′位于大肠埃希氏菌16SrDNA341～357bp)和907R(5′-CCGTCAATTCMTTTGAGTTT-3′位于大肠杆菌16SrDNA907～926bp)。按照Muyzer等所述的方法将1个40bpGC发卡结构(5′-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCG-3′)连接到引物341F的5′端。PCR反应混合物组成:上下游引物各25μmol/L,0.2mmol/LdNTP,2.0mmol/LMgCl2,2.5U的ExTaqDNA聚合酶(日本TaKaRa公司产品),以各不同浓度的DNA提取液作为模板。PCR反应条件如下:95℃预变性3min,共35个循环(每个循环包括:95℃1min,56℃1min;72℃1min),最后在72℃下延伸10min。PCR产物用作变性梯度凝胶电泳。用带有GC发卡结构的引物ARC344F(5P-ACGGGGYGCAGCAGGCGCGA-3P)和ARC915R(5P-GTGCTCCCCCGCCAATTCCT-3P)分析古细菌。PCR扩增反应混合物(共100mL)包括:5～100ng的DNA模板,1×EXTaq缓冲溶液(TakaraShuzo,Kyoto,Japan),dNTP250μmol/L,各引物25pmol,2.5U的EXTaqDNA聚合酶(TaKaRa公司生产),用2滴矿物油(Sigma)覆盖。PCR反应条件如下:在94℃下预变性5min,进行30个循环(每个循环包括:94℃变性1min,40℃1min;72℃1min),最后在72℃下延伸10min。1.2.3凝胶法pcrDGGE是按Muyzer等所述方法进行,采用D-gene和D-code系统(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA,USA),凝胶厚度为1.5mm。PCR产物直接上样到变性梯度为20%～60%的0.06g/mL的聚丙烯酰胺凝胶中(100%的变性剂是由7mol/L尿素和0.45g/mL的甲酰胺组成的)。切下DGGE条带,用带有GC发卡结构的引物341F与907R或带有GC发卡结构的ARC344F与ARC915R进行PCR再扩增。PCR二次扩增产物再次在变性凝胶中进行电泳以检验DGGE条带的纯度。PCR扩增产物用CONCERT快速PCR纯化试剂盒(Invitrogen,Carls-1bad,CA,USA)纯化后,送请上海生物工程公司测序。1.2.4系统发育树的构建所有的16SrDNA片段的序列通过BLAST在GenBank数据库中搜寻相似序列,将相关序列用DNA-MAN(version4.0)进行比对并构建系统发育树。本文中所报道的核苷酸序列数据已登陆NCBI/GenBank,序列接受号为EU912580到EU912600。2结果与分析2.1不同水样点样的样点样点样点cl-、mg2+、ca2+、na+和hco3-的浓度变化表1所示为石油集输系统中不同采样点处的物理、化学特性。从氧化还原电位可以看出,石油集输系统是一个厌氧环境。数据还显示,油井取样点水样中Cl-、Mg2+、Ca2+、Na+和HCO3-的浓度几乎和石油计量站和石油综合处理站的取样点相同。但是,从油井取样点到石油综合处理站取样点SO42-的浓度逐渐降低,而SO32-、S2O32-的浓度逐渐增加。这表明,由于石油集输系统是厌氧条件而且距离很长(约40km),因此在石油集输过程中发生硫酸盐还原为亚硫酸盐的反应。2.2细菌群落演替图1所示为石油集输系统水样中存在菌群的DGGE图谱,DGGE凝胶中显示较为明显的条带均被切下并测序,相关的各种微生物种属在表2中列出。来自3个不同取样位点水样的DGGE图谱显示,以下9个细菌种属相关的基因序列检出频率较高:Ochrobactrumanthropi、Stenotrophomonasmaltophilia、Acidovoraxsp.、Arcobactersp.、Pseudomonassp.、Thiomicrospirasp.、Brevibacteriumsp.、Tissierellasp.和Peptostreptococcussp.,说明这些细菌是油田产水中的典型菌群,不是由于石油集输系统污染造成的结果。而且,与Hippeamaritime相关的硫酸盐还原菌在3个水样中都被检出,这可能是导致水样中硫化物浓度较高的原因(表1)。硫酸盐还原菌(SRB)产生的硫化物会导致长距离石油集输系统管道的腐蚀,所以进一步研究硫酸盐还原菌非常重要。在油井井口、计量站、石油综合处理站所取的水样中菌群种类很相近,但是也存在着一定的群落演替,如图2所示。其中β-变形菌纲微生物相关序列在油井井口、计量站、石油综合处理站水样中所占的比例分别为27%,30%和25%;高-G+C革兰阳性菌相关序列在3处水样中所占的比例分别为9%、10%和8%;α-变形菌纲细菌在3处水样中所占的比例分别为18%、20%和17%。石油集输过程中水相中的微生物群落的相似性为83.3%,这说明在石油集输过程中微生物群落的结构是较为稳定的。不同取样点水样中也存在一些各自特有的细菌种属,与Methylobacteriumrhodium相关的微生物基因序列在油井井口水样中被检出,Methylobacteriumspp.是兼性甲基营养菌。而且,一些Methylobacteriumspp.能够氧化含2个或4个碳原子的烯烃,生成相应的1,2-环氧化物。Bacillus和Staphylococcus只在石油综合处理站的水样中检出。这些微生物种属分布的差异表明在石油集输过程中,水体中微生物生存环境发生了变化。2.3种特殊病毒群对石油集输系统3个不同取样点处原油样品中微生物菌群的变化情况进行了分析。DGGE图谱显示:原油中的各类菌群数量远低于同一位置的水样(如图1所示)。在石油集输过程中,原油中的菌群的相似性为88.2%,表明原油中的菌群结构比水中更为稳定(水样中的为81.3%)。原油中的特异性细菌,比如Burkholderiasp.、Brevundimonassp.和Propionibacteriumsp.只在油样中被检出;Ochrobactrumsp.和Stenotrophomonassp.在油样和水样中均被检出。这说明以上5种菌(Burkholderiasp.、Brevundimonassp.、Propionibacteriumsp.、Ochrobactrumsp.和Stenotrophomonassp.)是原油中的优势菌群(表2)。而且Ochrobactrumsp.和Stenotrophomonassp.原本只存在与原油中,在从油井井口到石油综合处理站这一集输过程中,它们从原油中扩散到水中。日本学者Watanabe等用分子生物学方法分析了油田地下水和原油储存罐中的细菌群落结构,但他们得出的细菌群落结构与本研究结果有很大差别,说明不同地区、不同地质地层所产石油中,微生物群落结构有所差别。2.4产甲烷菌群落用古细菌特异性引物尝试从采自石油集输系统中的原油样本和水样中研究古细菌的存在情况。结果发现,在原油样本中没有检测到与古细菌相关的16SrDNA。然而,在计量站油水重力分离器和石油综合处理站废水罐的水样中发现了一些产甲烷菌,序列聚类分析结果如图3所示。克隆QY14与Methanocalculussp.相关,与Methanomicrobials聚于同一菌簇中,该类细菌能够利用H2和CO2进行生长繁殖。克隆QY15,QY16和QY17分别与Methanogenicarchaeon,Methanosarcinasp.和Methanosaetasp.相关,与Methanosarcinales聚于同一菌簇中,该类细菌利用乙酸而不用H2或CO2生长。克隆QY21不属于已知的产甲烷菌簇,但是序列同源性分析显示它是一种嗜热菌(数据未给出)。Watanabe,etal.用16SrRNA基因克隆方法研究发现油田地下水中含有大量产甲烷菌,而且他们还估计,在油田地下水中甲烷生成的速率很高。一般情况下,产甲烷菌出现在包括产氢菌和硫酸还原菌在内的产甲烷菌群中,有文章称产甲烷菌只在石油污泥的样本中被检出过。在我们的研究中也发现,产甲烷菌存在于计量站油水重力分离器和石油综合处理站废水罐水样中,可能是一些产甲烷菌从罐底污泥扩散进了水中,所以产甲烷菌在水样中被检出。本研究从原油样本和水样中直接提取出