北运河湿地中厌氧氨氧化菌和氨氧化古菌的生物多样性分析

北运河湿地中厌氧氨氧化菌和氨氧化古菌的生物多样性分析

1氮循环的生物转化反应目前，人类活动对氮循环的干扰影响远远超过其他因素，极大地加速了地球表层环境的变化。自1911年世界第一个合成氨厂建成以来，由人类活动产生的全球固氮量约占总固氮量的60%。人类活动破坏了现有的氮循环。大量氮积聚在河流和湖泊之间，地下水被污染，氮素被严重污染。中国河流众多，但总体污染严重。河流湿地包括河流的岸边带,河边、河叉、河口的沼泽区,与河流连接的浅湖和池塘,是生命元素反应的活跃地带.氮循环过程主要包括植物和微生物同化吸收和贮存、生物硝化反硝化生成含氮气体、生物固氮等.传统氮迁移转化过程中氨只能由氨氧化细菌(AOB)在氨单加氧酶(AMO)的催化条件下,被氧化为亚硝酸盐/硝酸盐.随着人们对自然界氮循环认识的不断加深,发现氨的氧化反应还可以由氨氧化古菌(AOA)在古菌氨单加氧酶的催化条件下进行(Könnekeetal.,2005).而且发现氨的氧化不仅在有氧条件下进行,还可以在厌氧/缺氧的条件下,由厌氧氨氧化菌以亚硝酸盐为电子受体进行氧化,定义为厌氧氨氧化(Anammox)(Zhuetal.,2008).恢复正常的氮循环是控制氮素污染的根本措施.古菌硝化反应的发现使人们重新认识氨氧化过程这一氮循环中的限速步骤,而厌氧氨氧化将氨与硝酸盐直接作用完成封闭的氮循环,而且两种反应过程均可在缺氧条件下进行,不消耗水体中的氧.如果古菌硝化和厌氧氨氧化能在氮循环模式得到部分实现,不仅可以减少N2O排放量,对于氮循环失衡造成的其它氮素污染,如水体富营养化、水体缺氧、地下水污染等,也是一种较佳的解决方法.但是目前关于氨氧化古菌和厌氧氨氧化的研究和报道,多限于海洋生态系统,在大陆表层,特别是淡水湿地生态系统,还鲜有报道(Zhuetal.,2010).本研究本着河流生态修复的目的和观点,积极探讨在河流湿地中是否存在这两种氮迁移转化过程的新机制与新型微生物,以期为恢复河流生态系统正常的氮循环提供思路.2试验方法2.1采样点和沉积物以海河支流北运河为研究对象.在北运河沿程共布设8个采样点,如图1所示.采样点自北运河上游位置的顺义区后沙峪镇开始,沿途经过北京、河北最终至天津市武清区,全程超过120km.采样点主要选取支流汇入点以及典型污染区域的上下游,基本覆盖了北运河干流的不同污染特点地带.沉积物主要采取表层沉积物(20cm),冷藏保存(0～4℃)至实验室后-20℃保存直至DNA提取.2.2理化指标、氨氮和硝氮的测定上覆水理化指标的测定:溶解氧浓度(DO)用溶解氧仪(YSI550A)现场测定,pH值用pH计(DELTA320,METTLERTOLEDO)测定,水样其它指标的测定均按照《水和废水监测分析方法》(国家环境保护总局,2002)进行.沉积物样品理化指标的测定:全氮(TN)、全磷(TP)和有机质的测定均按照《土壤农化分析》规范进行(鲍士旦,2000).氨氮和硝氮的浓度用连续流动分析仪(SAN++,荷兰Skalar公司)测定.2.3浮霉菌属的pcr扩增和生物活性检测沉积物DNA采用FastDNAspinkitforsoil(Bio101,USA)进行样品的DNA提取.厌氧氨氧化菌扩增采用巢式PCR,首先使用引物pla46f(5′-GGATTAGGCATGCAAGTC-3′)和通用引物630r(5′-CAKAAAGGAGGTGATCC-3′)对浮霉菌属进行PCR扩增(Neefetal.,1998;Juretschkoetal.,1998);第二步以第一步PCR产物作为模板,使用厌氧氨氧化细菌特异性引物对Amx368f(5′-TTCGCAATGCCCGAAAGG-3′)和Amx820r(5′-AAAACCCCTCTACTTAGTGCCC-3′)进行厌氧氨氧化菌16SrRNAPCR扩增(Schmidetal.,2000;2003).氨氧化古菌扩增参照文献(Francisetal.,2005).2.4阳性克隆测序及进化树的构建使用PromegaAgaroseGelDNA(Promega,Madison,WI)纯化试剂盒对PCR扩增产物进行切胶纯化,将PCR回收产物与pGEM-Teasy(Promega,Madison,WI)载体进行连接后,转入JM109感受态细胞,最后进行蓝白筛选.阳性克隆的检验所用引物为T7、SP6,挑取阳性克隆子,用限制性内切酶HhaⅠ分型,挑取菌株进行测序(北京Biomed生物科技有限公司).应用DNASTAR软件对测序结果进行编辑,去除载体序列后用BLAST在基因库中搜索相似序列.同时将该序列与已发表的相关细菌的16SrRNA序列进行多重序列对齐,使用MEGA3.1软件以邻接法(Neighbor-Joining)构建进化树.独立操作单元(OTU)利用DOTUR软件进行划分.3上覆水上覆水总氮浓度和氨氮浓度的变化北运河采样点上覆水和沉积物的理化性质如表1所示.从表1可以看出,上覆水的氨氮浓度和总氮浓度从采样点1点至8点逐渐降低,硝氮浓度则呈现不规则变化;沉积物样品中污染物浓度变化并不明显.3.1厌氧氨氧化细菌克隆经PCR反应后,在采样点6处得到厌氧氨氧化菌的阳性结果.6号采样点位于河北省香河境内,岸边以杂草为主,水面发黄,河流宽约70～100m.地处农村,人口稀少,附近未见工业建筑.1～5采样点和7号采样点(北京排污河)未得到厌氧氨氧化菌PCR阳性结果,其可能原因是因为这些点有大量的发散小点源污水、工业废水、污水处理厂出水汇入,其中含有大量的化学物质、重金属等污染物,可能是抑制厌氧氨氧菌生长的原因.虽然上覆水和底泥沉积物均检测到氨和亚硝酸盐的共存,但是同时发现有机质浓度偏高,异养菌的优势生长会限制厌氧氨氧化菌的生长.8号采样点地处天津境内,此处河流为硬质护岸,微生物难以附着及生长,难以形成厌氧氨氧化菌及其他微生物的良好共生群落结构.通过表1对比可以发现,在发现厌氧氨氧化菌的6号点水质和底泥沉积物污染物水平均较其他采样点低,说明其在河流氮循环修复过程中,正发挥着积极的作用.不同于6号点,8号采样点水质变好的原因很可能是稀释作用的影响.此采样点位于八孔闸下游,在此处众多河流交汇,包括龙凤河、柳河干渠、黄沙河排水干渠、东粮窝引河.以6号采样点样品构建厌氧氨氧化菌克隆文库.实验共获得96个白色克隆,利用限制性内切酶HhaⅠ对克隆酶切进行初选,选取30个克隆进行测序.测序结果在GenBank数据库中进行Blast比对(见表2),用DOTUR软件对所得的每个克隆的生物多样性分析比较,得到3个不同的OTUs(相似性小于97%),生物多样性比较低.从表1可知,第一个OTU包括1个序列NC-ANAMMOXbacteria-6-18,它与Candidatus“Kueneniastuttgartiensis”(最初发现于厌氧氨氧化滴滤池反应器中)最为相似,相似度达到98%.第二个OTU中包括11个序列,其与Candidatus“Brocadiafulgida”(最初发现于生物反应器中)最为相似,相似度达到95%.第三个OTU中包括18个序列,其与Candidatus“Brocadiafulgida”最为相似,相似度为95%.北运河作为北京主要的排水河道,接受大量污水的汇入,其所得厌氧氨氧化细菌克隆与生物反应器中发现的厌氧氨氧化细菌更为接近.以本研究得出的序列和其相关的环境样本,构建系统发育树(图2).由图中可以看出,本研究得出的序列与已知的厌氧氨氧化菌具有很好的亲缘关系,但是生物多样性不高,仅含有2种厌氧氨氧化菌.这一研究结果与以往研究具有一定的相似性.以往在自然生态系统或人工生态系统中发现的厌氧氨氧化菌,生物多样性均较低,例如Candidatus“Scalinduabrodae”存在于东非Tanganyika湖(Schubertetal.,2006),Candidatus“Jetteniaasiatica”存在于上向流厌氧反应器(Quanetal.,2008).而Schmid等人(2007)还发现在海洋生态系统中,所有的厌氧氨氧化菌都属于Candidatus“Scalindua”属,进一步说明每种厌氧氨氧化菌都有特定的存在环境,本研究也证实了此结论.但是到目前为止,环境因子与厌氧氨氧化细菌的分布特征之间的关系还不是非常清楚.厌氧氨氧化在缺氧海域的普遍存在,表明厌氧氨氧化是引起海洋固氮损失的主要原因.但是在大陆表层,关于厌氧氨氧化的报道还很少(Zhuetal.,2010).3.2南果梨酒在不同生态系统中的生物多样性经PCR反应后,发现在6号采样点得到氨氧化古菌的阳性结果.关于其他点,特别是1～5点和7点,不存在AOA的可能原因很可能是其中有机污染物、重金属的作用所致.目前关于氨氧化古菌的研究,国际处于探索阶段,仅分离出一种ADA(KönnekeM,2005),其关键生长因子及影响因素、生长速率及共生微生物等,均处于未知状态.但是可以推测,在6号采样点处,AOA能够与厌氧氨氧化菌形成共生关系,且共同对水相和沉积物氮循环的修复起着积极作用.实验共得到96个白色克隆,利用限制性内切酶HhaⅠ对克隆进行酶切,得到6个具有不同序列的克隆.对所得的每个克隆的生物多样性分析比较,得到5个不同的OTUs,见表2.OTU1和OTU2均包括1个序列,其分别与蔬菜地(中国)和太湖沉积物中发现的泉古菌最为相似,相似度分别为99%、98%.OTU3同样包括1个序列,其与土壤(中国)中发现的AOA最相似,相似度为98%.OTU4(1个序列)、OTU5(2个序列)与农田(中国)中发现的泉古菌最为相似,相似度分别为95%和98%.泉古菌的生物多样性在海洋沉积物和水相中都有报道(Francisetal.,2005),但是在淡水河流沉积物中还很少报道.AOA在土壤、海洋水相和沉积物中也均有分布,且发现AOA与其生长环境具有很大的相关性,水相、土壤样品很少重叠,本研究也证实了此结论.对本实验样本和水体(watercolumngroup)、土壤/沉积物(soil/sedimentgroup)两大进化分支中的不同AOA进行建树分析(图3),发现北运河岸边带湿地的古菌amoA序列都与土壤/沉积物进化分支中的AOA聚为一簇,而与水相中的AOA进化关系较远.本研究在河流岸边带湿地中发现AOA的存在及其生物多样性,表明其在淡水湿地生态系统的氮循环过程中占有重要地位.但是目前,AOA在不同生态系统中的生物地球化学作用还不清楚,还有很多需要广泛而深入研究的科学问题,例如①古菌硝化的活性和最大反应速率;②AOA和AOB的自然丰度和分布特性;③硝化反应在不同催化酶作用下的关键影响因素和过程效应等.4城市湿地污染控制与湿地氮循环研究通过对典型河流湿地生态系统中新型氮循环微生物的鉴定和多样性研究,证实在淡水河流湿地生态系统中存在厌氧氨氧化菌和氨氧化古菌,且呈现不同的分布特性.厌氧氨