假单孢杆菌pke117对木材的降解研究

假单孢杆菌pke117对木材的降解研究

木质素是自然界的第二大有机碳来源。它具有香味浓郁，难以分解。同时,也是造纸黑液的主要成分,使造纸废水的处理十分困难,造成严重的水污染。目前已知的木材腐朽菌包括真菌、放线菌和细菌,其中具有降解木质素能力的白腐真菌是一直以来研究的重点。而细菌由于其所分泌的木材降解酶基本上都是胞内酶,对于细菌降解木材的研究一直处于从属地位。假单孢杆菌(Pseudomonas)是细菌中对木材降解效果较好的一种。本研究使用的假单孢杆菌PKE117经实验证明具有分泌胞外木素降解酶的能力。用该菌种对巨尾桉、加拿大杨和长白落叶松这三种常见木材进行降解。通过测定木材降解率发现,该菌种具有较强的降解木材的能力,尤其对松木的降解能力很突出。用元素分析、红外光谱、固相核磁等手段对降解前后的木材结构变化进行分析,发现木材结构中的纤维素和木质素结构都发生了一定程度的变化,证明该菌种具有降解纤维素和木质素的能力。1材料和方法1.1材料表面1.1.1病毒假单孢杆菌PKE117,北京大学环境工程实验室保存。1.1.2木材巨尾桉(优6),廉江;加拿大杨,怀柔北溟林场木材加工厂;长白落叶松,怀柔北溟林场木材加工厂,分别记为A、Y、S。1.1.3灭菌、灭菌固体斜面培养基:牛肉膏0.3%,蛋白胨1%,NaCl0.5%,琼脂1.5%,121℃下灭菌30min。无机盐营养液(g·L-1):K2HPO41,NaH2PO41,(NH4)2SO410,MgSO4·7H2O0.5,Ca(NO3)20.2,FeSO40.1,MnSO40.02,水1000ml,pH7.2,121℃下灭菌30min。1.2仪器和方法1.2.1核磁共振波谱仪am-400,红外光谱仪;核磁共振波谱仪;光谱体,光谱能谱仪;元素分析仪VarioEL(德国Elementar),核磁共振波谱仪AM-300(德国Bruker),红外光谱仪EQUINOX(德国Bruker)。1.2.2木材降解率和元素分析试验木材粉碎后过60目筛,50℃烘至恒重。取一定量木屑装入培养皿中,121℃下灭菌1h,冷却后加入一定量无菌的无机盐营养液,使木屑充分湿润。接种活化24h的斜面种子,接种量为106个/g木屑,28℃恒温培养,每隔6d定时定量补充无机盐营养液,培养60d后取出培养物,用无菌水充分洗涤,滤纸过滤去除菌体后称量残余木屑重量,根据差值法计算出木材的降解率。将降解前后的样品在80℃条件下烘干至恒重后,进行元素分析、红外扫描和固相核磁分析,比较降解前后样品结构变化。其中,降解率和元素分析试验结果取各平行样的平均值。固相核磁和红外光谱取变化较为明显的样品图谱。2结果与讨论2.1木材腐蚀真菌对山杨材、桉木、白砂糖的降解假单孢杆菌PKE117对巨尾桉、加拿大杨和长白落叶松三种木材的降解率分别为7.58%、17.15%和26.75%;对长白落叶松的降解率明显大于加拿大杨和巨尾桉。池玉杰等用东北林区64种木材腐朽菌对红松和青杨2种木材进行了46d降解的实验,结果表明这64种菌对青杨的降解率为0.3%～52.2%,平均值为17.6%;对红松材降解率为0%～19.8%,平均值为6.8%。池玉杰在用6种木材白腐菌对山杨材的降解实验中发现,60d内降解率为18.0%～24.2%。TerhiK等人用93种木材腐朽真菌对挪威云杉(松科)进行的70d降解实验中,降解率为0.6%～22.7%。J.C.delR1′o等人用担子菌对蓝桉进行的56d降解实验中,降解率为4%～20%。J.C.delR1′o等人用16种真菌对蓝桉进行的40d降解实验中,降解率为0.1%～25.9%。对比文献和本研究结果(见图1)可知,假单孢杆菌PKE117对松木的降解效果明显优于文献中所采用的木材腐朽菌,且对杨木和桉木的降解能力则略高于平均水平。文献中除烘干温度、培养时间和样品大小外,基本步骤一致,都没有提供在不加菌种时样品受其他影响的失重率,故在比较时没有加入这个因素进行比较。但这仍是个粗略的比较。考虑到长白落叶松和加拿大杨、巨尾桉在木质素和半纤维素成分上的差异,该菌种对三种木材降解率的不同可能是由于该菌种具有独特的降解半乳糖单元或者愈创木基丙烷结构的能力。桉木的降解率较低则可能是存在抑制该菌种生长的物质,或者缺乏可供该菌种利用的聚糖造成的。2.2分解前后木材结构分析2.2.1c=o与c-o三种木材在降解前的C含量为48.54%～48.86%,差别很小,见表1(所列数据为两个平行样本的平均值)。这是由于木材在进行元素分析之前,为避免水分的影响,在80℃条件下烘干至恒重。据报道,在完全烘干的情况下,各种木材的C含量基本一致。降解后,三种木材的C、H含量均降低,而O含量增高,初步认为是由于C=C结构同氧发生反应形成C=O或C-O造成的。木材三个主要成分——纤维素、半纤维素和木质素的C∶O比值不同,其中纤维素的C∶O=100∶83.35,半纤维素葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖的分子式为(C6H10O5)n,(C5H10O5)n,C∶O=100∶120,C∶O=100∶100,而葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸的分子式为C6H10O7,C∶O=100∶116。木质素三种基本结构中,愈创木基丙烷C∶O=100∶20,紫丁香基丙烷C∶O=100∶27.3,对羟苯基丙烷C∶O=100∶11.1。C∶O比值的降低,即O元素相对比例的增高,可能是木质素相对比例降低造成的。对比这三种木材降解前后C∶O的变化,最明显的是杨木,其次是松木,变化最小的是桉木。但松木的降解率高于杨木。出现这种情况,可能是由于假单孢杆菌PKE117只是更多使杨木组成成分官能团发生了改变,而不是将其分解成小分子;或者是因为木质素和半纤维素的成分不同,导致降解途径也不同。2.2.2降解前后各峰面积和相对比值变化对样品进行13C核磁测试以分析其结构变化。得到图谱后,首先对主要的几个峰进行归属和积分。峰的归属和各峰积分值占总积分值比例见表2。现将各积分值做比较,结果见表3。由降解前三种木材样品的固相核磁图谱可知,巨尾桉和加拿大杨羰基含量和甲氧基含量明显高于长白落叶松,而长白落叶松中愈创木基结构含量明显高于其他两种木材。从降解前后各峰面积(表2)及其相对比值变化(表3)来看,巨尾桉和加拿大杨羰基含量略有增多,紫丁香基所占比例增多,但愈创木基结构所占比例降低,纤维素半纤维素含量相对增多,芳基甲氧基结构含量略有降低,且仅从各峰值所占比例的变化来看,巨尾桉和加拿大杨的变化程度差别不大;长白落叶松羰基含量明显增多,木质素结构中愈创木基结构含量相对降低,而纤维素半纤维素含量相对于木质素明显降低,芳基甲氧基结构相对增高。在以纤维素和其他多糖为基数进行比较的两项指标(H/G,C/F)里面,加拿大杨和巨尾桉样品的变化趋势都是降低或者不变,而长白落叶松样品降解后的比值却是升高或大幅升高。再结合A/F和E/F两项指标,可以推断长白落叶松中的聚糖结构降解幅度很大。这可能是由于落叶松中独有的阿拉伯半乳聚糖分枝度大、易水解,更易被假单孢杆菌PKE117利用造成的。综合固相核磁的分析结果,认为各样品被降解后木质素中的愈创木基结构比例降低,长白落叶松的半纤维素被降解的程度比其他两种木材高,且印证了前面关于O元素所占比例增多,是由于羰基数量增多的猜测。2.2.3破坏峰与破坏结构的比较对降解前后的样品进行红外光谱扫描,扫描波段为400～4000cm-1。鉴于木材结构主要特征峰集中在800～2000cm-1,故主要对这一区域的峰进行归属[16,17,22,24,25,26,27,28],并分析降解前后峰的变化,结果如下。由于木材成分复杂,所以图谱上所标注的只是各个峰主要代表的成分。对比降解前三种木材红外谱图可知,巨尾桉和加拿大杨这两种阔叶木的红外谱图峰形相似,而长白落叶松的红外谱图峰形同另外两种差别较大。O-CH3同木质素芳香环结构中的C=C峰高的比值,巨尾桉、加拿大杨高于长白落叶松;长白落叶松愈创木基结构的峰突出,巨尾桉和加拿大杨紫丁香基结构的峰突出,这是因为针叶木的木质素以愈创木基结构为主,只含很少量的紫丁香基和对羟基。巨尾桉被破坏的有碳碳双键(C=C)和酯结构(C-O-C),有轻微被破坏的痕迹,但是同苯环相连的甲氧基以及苯环结构本身并没有被破坏的迹象。总体来说,巨尾桉样品在降解前后峰形的变化并不明显,木质素结构并没有被降解的迹象。从加拿大杨降解前后的红外图谱(图3)对比中可以看出,降解后紫丁香基结构的峰变得更突出;碳碳双键(C=C)结构峰值相对降低,羰基(C=O)峰变得突出。甲氧基结构的峰相对于芳香环结构中的C=C和紫丁香基的峰都明显降低。说明在降解过程中加拿大杨样品中大量的碳碳双键被氧化成羰基;愈创木基结构被破坏,使得木质素结构中残留的主要为紫丁香基结构。综合愈创木基、芳基甲氧基和酯结构的特征峰变化情况,认为愈创木基结构在苯环上甲氧基的位置被破坏,形成了链状的酯。而氧含量大幅增加,就是碳碳双键被氧化成羰基造成的。而综合核磁图谱和红外图谱的分析,认为加拿大杨中的聚糖结构并没有明显被降解的迹象。从长白落叶松降解前后的红外图谱(图4)中可以看出碳氧键(C-O)结构峰升高,羰基(C=O)没有明显升高。甲氧基结构相对于芳香环结构中的C=C降低,相对于愈创木基结构则升高;芳基结构中的C=C相对于愈木创基结构降低。结合前文的分析,认为长白落叶松样品在降解过程中,愈创木基结构除甲氧基结构有明显被破坏的迹象外,苯环亦被破坏。羰基并没有明显增多,但核磁积分结果显示,相对半纤维素结构而言,长白落叶松中羰基大幅升高。那么,这个比值的升高应该是由于半纤维素结构被破坏而导致的。同时,C-O-C的峰变高并向左发生偏移,也就是说,苯环在连有甲氧基的位置断裂,形成了链状的酯。总结以上分析,可推断长白落叶松中半纤维素和木质素结构都被破坏。其中木质素是从苯环连有甲氧基的位置断裂。3微生物及其产物假单孢杆菌