肾康丸对糖尿病肾病大鼠肾小球足细胞形态及dupr表达的影响

肾康丸对糖尿病肾病大鼠肾小球足细胞形态及dupr表达的影响

糖尿病性肾炎（dn）是糖尿病的主要并发症之一，发病率高，治疗方法复杂，治疗效果差。通常进行于端头期，并对疾病产生重大影响。近年来的研究表明，肾衰竭是dn持续发展的关键。足细胞破裂和愈合性皮炎是选择肾功能过滤障碍的关键之一。德明可以用作光显微镜下足细胞损伤的指标。目前DN的西医治疗措施除饮食治疗、控制血糖等之外,以血管紧张素转换酶抑制剂和血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂的应用最为广泛和重要,但这些方法临床疗效均相当有限,迄今尚无针对DN的特异性西药。中医药在DN的治疗方面具有比较明显的优势,但绝大多数尚处于疗效观察和经验积累阶段,目前国内外未见对DN具有确切疗效的中药新药问世。我们在对DN的长期临床治疗和研究过程中,精心筛选提炼药物组方,命名为肾康丸,经反复临床验证,疗效十分确切,并已获得国家发明专利(专利号200610036515.2)。本研究旨在通过观察DN模型大鼠足细胞形态改变及desmin、podocin表达的变化,探讨肾康丸对DN的肾保护作用机制。1材料和方法1.1药品、制剂及菌株雄性SD大鼠56只,体质量180~230g,购自中山大学实验动物中心。肾康丸(由黄芪、水蛭、金樱子、益母草等组成),南方医科大学珠江医院药剂科生产,制剂号20031214。厄贝沙坦片(安博维),杭州赛诺菲圣德拉堡民生制药有限公司生产,批号(2000)J-24。链脲佐菌素(STZ,Sigma)、酶联免疫吸附测试大鼠尿微量白蛋白试剂盒、24h尿蛋白定量试剂盒(广州威佳科技有限公司)、兔抗desmin抗体、兔抗podocin抗体(Boster)、抗体稀释液(DAKO)、Envision免疫组化试剂盒(广州基因有限公司)。1.2方法1.2.1大鼠dn模型及分组所有动物适应性喂养1周后,禁食12h,空腹状态下、STZ按55mg/kg一次性腹腔注射,STZ临用前用枸橼酸钠缓冲液(0.1mol/L,pH4.5)配制。另设正常对照组(n=8),注射等量枸橼酸钠缓冲液。全部大鼠标准饮食喂养,不使用胰岛素及其他降糖药物。72h后开始监测空腹血糖、尿糖、尿量、24h尿微量白蛋白排泄率的变化,若连续3次达到下列标准者,即认为DN模型建立:(1)空腹血糖>16.6mmol/L;(2)尿糖强阳性;(3)尿量>原尿量150%;(4)24h尿微量白蛋白排泄率>30mg/24h。大鼠造模成功后,随机分为4组(n=12):DN模型对照组、肾康丸组、厄贝沙坦组、肾康丸和厄贝沙坦合用组。肾康丸、厄贝沙坦分别按3000mg/(kg.d)、50mg/(kg.d)每日分2次灌服[按照人与大鼠体表面积换算,分别相当于成人300mg/(kg·d)、5mg/(kg·d)],连续8周。对照组灌服等量生理盐水。1.2.2大鼠的消毒处理实验结束前1d代谢笼收集24h尿液,计24h尿量。大鼠处死前称质量;以0.3%戊巴比妥钠按35mg/kg质量的剂量腹腔注射麻醉,腹主动脉取血,分离血清,-20℃保存;取双侧肾脏,称重后液氮冻藏。1.2.324小时尿微白试验1.2.424小时尿蛋白试验1.2.5甲苯磺酸盐的染色大体标本观察。光镜观察:肾组织经10%中性缓冲福尔马林固定,梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋、切片后,HE、PAS、Masson三色染色观察。取约1mm3的肾皮质组织块,经2.5%戊二醛固定、1%饿酸后固定、脱水、环氧树脂618包埋,超薄切片后醋酸铀-柠檬酸铅染色,JEM1010透射电镜下观察。1.2.6成全性过氧化物酶模型采用二步法,5μm肾组织石蜡切片梯度脱蜡水化后,3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶,PBS缓冲液(0.01mol/L,pH7.4)洗涤,正常兔血清封闭,依次加入desmin抗体、EnVision标记二抗,DAB显色,苏木精复染,树脂封片。相同方法检测podocin的表达。1.2.7小鼠小鼠血清中etmin的表达情况采用JD-801计算机图像分析系统,每组随机取8张切片,在每张切片上随机选取10个肾小球,计算每个肾小球内阳性信号面积与肾小球面积的比值,取其平均值作为该实验动物的指标值,计算各组肾小球内desmin的阳性信号面积百分比。相同方法计算podocin的阳性信号面积百分比。1.2.8统计方法观察指标以均数±标准差表示,采用方差分析,用SPSS13.0软件对实验数据进行统计学处理。2结果2.12肾康丸对24h尿蛋白定量的影响DN模型对照组大鼠24h尿蛋白定量明显高于正常对照组(P<0.01)。与DN模型对照组比较,肾康丸组、厄贝沙坦组24h尿蛋白定量均明显减少(P<0.05),两药合用组减少更明显(P<0.01);与肾康丸组、厄贝沙坦组比较,两药合用组24h尿蛋白定量亦明显减少(P<0.05);肾康丸组、厄贝沙坦组之间比较无统计学差异(P>0.05)。2.2透射电镜检测足突部分融合DN模型对照组大鼠处死前可见大量腹水;肾脏外观苍白、肿胀、质地变硬;HE、PAS和Masson三色染色,光镜下可见肾小管大量蛋白管型,肾小管上皮细胞脱落、空泡变性,肾间质炎性细胞浸润,肾小球轻度系膜增生、基底膜未见明显异常;透射电镜显示足突部分融合,足细胞肿胀、破裂、溶解。经药物干预后各组上述病理变化均明显减轻,尤以两药合用组变化更为显著(图1,2)。2.3肾康丸对肾贝沙坦组小鼠肝肾7d阳性面积年龄的影响Desmin可大量表达于足细胞内。通过油镜放大观察,模型对照组足细胞desmin阳性显色明显,经药物干预后各组阳性显色均明显减少,尤以两药合用组变化更为显著(图3)。半定量分析显示:与DN模型对照组比较,肾康丸组、厄贝沙坦组肾小球desmin阳性面积百分比均有显著性差异(P<0.05),两药合用组显著性差异更明显(P<0.01);与肾康丸组、厄贝沙坦组比较,两药合用组阳性面积百分比亦有显著性差异(P<0.05);肾康丸组、厄贝沙坦组之间比较无统计学差异(P>0.05,图3,4)。2.4podocin的表达使用免疫组化染色定位分析,podocin局限性分布于肾小球,在小管和间质未见分布,各组间podocin的分布未见明显差异。半定量分析显示:podocin的表达在正常对照组最高,模型对照组最低(P<0.01),经药物干预后各组阳性显色均明显增加,但仍然低于正常对照组(P<0.01);与DN模型对照组比较,肾康丸组、厄贝沙坦组、两药合用组肾小球podocin阳性面积百分比均有显著性差异(P<0.01);3个治疗组之间比较无统计学差异(P>0.05,图5,6)。3肾康丸对dn的保护作用Podocin是由定位于1q25-31的NPHS2基因编码、表达于SD上的一种整合膜蛋白,NPHS2基因突变可导致常染色隐性遗传性类固醇抵抗型肾病综合征,podocin缺失的小鼠可出现严重的蛋白尿、肾功能损伤及肾小球足突的广泛融合。目前,关于podocin在DN中的变化及作用机制的研究报道较少,且结果不一。Menne等发现DN时podocin的表达无显著性改变;Awad等则发现DN时podocinmRNA与蛋白的表达均出现显著下调。本实验中我们发现,STZ诱导的DN大鼠模型肾组织podocin的表达出现显著下调;应用肾康丸、厄贝沙坦干预后,肾组织podocin的表达均显著增加。本实验结果表明,通过上调足细胞podocin的表达,使podocin蛋白的合成增加,从而维持SD形态的完整和滤过功能的正常,可能是肾康丸对DN的肾保护作用机制之一。按照试剂盒说明书,采用酶联免疫吸附法检测。按照试剂盒说明书,采用Bradford法检测。历代医家对DN的病机认识尽管有所不同,但多数认为乃肺、脾、肾三脏亏虚而致,阴虚为本、燥热为标是其基本病机,并贯穿于疾病发生、发展的全过程。我们认为,DN患者久病多耗气伤阴,累及脾肾,导致脾肾亏虚,气阴两伤。气虚血行无力,病久入络,易致血行瘀滞,故多兼夹瘀血阻络之证。脾虚清阳不升,失于健运,水谷精微之气无以化生。肾虚固摄无权,精微持续下注,失于流畅而外泄,则可出现蛋白尿。因此,治疗上以益气健脾、滋肾养阴兼活血通络为法。肾康丸组方中,黄芪益气健脾,敛精降糖;金樱子滋阴补肾,滋而不腻;益母草、水蛭活血通络,起标本兼治之功。我们应用肾康丸治疗糖尿病肾病7年余,肾康丸制成本院自制制剂用于临床亦已3年余,经反复临床验证,疗效十分确切,能显著减少蛋白尿,改善患者一般情况,有效地延缓DN的进展,且价格便宜,可明显减轻病人的经济负担,也适合病人长期服用。近年的研究发现,足细胞损伤是导致DN持续进展的关键。糖尿病时,高血糖、高血压等多种因素可通过细胞因子、活性氧基团、及改变血流动力学等导致足细胞脱落或发生凋亡。足细胞数目减少和肾小球基底膜的裸露导致肾小球组织形态学的一系列变化,从而引起尿蛋白的产生,加速肾损害进程;另一方面其自身也可表型转化为成纤维样细胞,直接或通过产生某些促细胞外基质生长因子,促使ECM聚积,导致DN的形成与发展,最终促发和加速肾小球硬化和终末期肾脏病的进程。desmin可作为光镜下足细胞损伤的标志。Blanco等发现2型DN模型大鼠第16、24、32周肾小球内desmin表达均显著增加;覃乔静等应用Wistar大鼠按STZ60mg/kg一次性腹腔注射建立糖尿病模型,5周后发现大鼠肾小球内desmin表达显著增