沉淀分离技术

沉淀分离技术第三章PrecipitationTechnology沉淀的目的通过沉淀达到浓缩的目的通过沉淀，固液分相后，除去留在液相或沉积在固体中的非必要成分沉淀可以将已纯化的产品由液态变成固态，加以保存或进一步处理沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。§3.1沉淀法概述沉淀方法用于分离纯化是有选择性的，即有选择地沉淀杂质或有选择地沉淀所需成分。生物分子在水中形成稳定的溶液是有条件的，这些就是溶液的各种理化参数。任何能够影响这些条件的因素都会破坏溶液的稳定性。沉淀法就是采用适当的措施改变溶液的理化参数，控制溶液的各种成分的溶解度，从而将溶液中的欲提取的成分和其它成分分开的技术。AddYourTitleAddYourTitleAddYourTitle.加入沉淀剂沉淀剂的陈化促进粒子生长离心或过滤收集沉淀物沉淀法操作步骤：加沉淀剂的方式和陈化条件对产物的纯度、收率和沉淀物的形状都有很大影响沉淀能否发生沉淀剂或沉淀条件下对活性结构是否有破坏作用沉淀剂是否容易除去沉淀剂是否对人体有害沉淀过程应考虑的问题沉淀技术分离生化产物的典型例子是蛋白质的分离提取

优点：设备简单、成本低、原材料易得、便于小批量生产；

缺点：所得沉淀物可能聚集有多种物质，或含有大量的盐类，或包裹着溶剂，产品纯度常比结晶法低，过滤也较困难。eg.从血浆中通过5步沉淀生产纯度高达99%的免疫球蛋白和96%~99%的白蛋白。图1利用蛋白质沉淀大规模提纯白蛋白与免疫球蛋白的工艺流程图沉淀法分离蛋白质的特点：生产前期可使原料液体体积很快减小10~50倍，从而简化生产工艺、降低生产费用；使中间产物保持在一个中性温和的环境；可及早将目标蛋白从其与蛋白水解酶混合液中分离出来，避免蛋白质的降解，提高产物稳定性；用蛋白质沉淀法作为色谱分离的前处理技术，可使色谱分离使用的限制因素降低到最少。§3.2蛋白质的溶解特性蛋白质的溶解行为是一个独特的性质，由其组成、构象以及分子周围的环境所决定。蛋白质在自然环境中通常是可溶的，所以其大部分是亲水的，但其内部大部分是疏水的。一般而言，小分子蛋白质比起在化学上类似的大分子蛋白质更易溶解。蛋白质是两性高分子电解质，主要由疏水性各不相同的20种氨基酸组成。亲水性氨基酸残基基本分布在蛋白质立体结构的外表面。水分子在水溶液中，多肽链中的疏水性氨基酸残基具有向内部折叠的趋势，即便如此，一般仍有部分疏水性氨基酸残基暴露在外表面，形成疏水区。疏水性氨基酸含量高的蛋白质的疏水区大，疏水性强。蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成荷电区、亲水区和疏水区构成疏水区（憎水区）亲水区荷电区蛋白质性质溶液性质分子大小溶剂可利用度（如：水）氨基酸组成

pH值氨基酸序列离子强度可离子化的残基数温度极性/非极性残基比率极性/非极性残基分布氨基酸残基的化学性质蛋白质结构蛋白质电性化学键性质表1影响蛋白质溶解度的参数水化层蛋白质周围的水化层可以使蛋白质形成稳定的胶体溶液电荷蛋白质分子间静电排斥作用防止蛋白质凝聚沉淀的屏障：§3.3蛋白质胶体溶液的稳定性蛋白质粒子在水溶液中是带电的，带电的原因主要是吸附溶液中的离子或自身基团的电离。因溶液是电中性的，水中应有等当量的反离子存在。蛋白质表面的电荷与溶液中反离子的电荷构成双电层。蛋白质分子蛋白质分子静电斥力范德华引力颗粒间的相互作用偶极力色散力诱导力颗粒间的相互作用的位能取决于离子强度在低离子强度时，颗粒距离处在中间状态，双电层斥力占优势，可看为一个凝聚的势垒在高离子强度时，吸引力超过排斥力，相互间的总位能表现为吸引位能DLVO理论高离子强度低离子强度虽然这个理论所假定的条件并不完全适合于蛋白质分子，但该理论对于理解破坏蛋白质溶液的稳定性仍有很大帮助，同时还有助于针对具体蛋白质选择最合适的沉淀剂及技术。DLVO理论颗粒间的相互作用的位能取决于离子强度。在低离子强度时，颗粒距离处在中间状态，双电层斥力占优势，可看为一个凝聚的势垒；在高离子强度时，吸引力超过排斥力，相互间的总位能表现为吸引位能。虽然这个理论所假定的条件并不完全适合于蛋白质分子，但该理论对于理解破坏蛋白质溶液的稳定性仍有很大帮助，同时还有助于针对具体蛋白质选择最合适的沉淀剂及技术。其他沉淀法金属沉淀法聚电解质沉淀法非离子型聚合物沉淀法§3.4蛋白质沉淀方法有机溶剂沉淀法等电点沉淀法中性盐盐析法一、中性盐沉淀法（盐析法）盐析：在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低，产生沉淀的过程。1、盐析的概念及过程概念缺点得到的样品欲继续纯化，需花一定时间脱盐优点①成本低，不需要特别昂贵的设备②操作简单、安全③对许多生物活性物质具有稳定作用早在1859年，中性盐盐析法就被用于从血液中分离蛋白质，随后又在尿蛋白、血浆蛋白等的分离和分级中使用，得到了比较满意的结果。盐析盐溶过程蛋白质在等电点时，容易互相吸引聚合沉淀。加入盐离子后，破坏了吸引力，增加静电斥力，使分子散开，溶解度增大？？？蛋白质和酶均易溶于水，分子中的－COOH、－NH2和－OH等亲水基团，与极性水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成亲水胶体，削弱了蛋白质分子之间的作用力，蛋白质分子表面极性基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，因而溶解度也越大。2、中性盐沉淀蛋白质的基本原理水化膜电荷亲水胶体在水中的稳定因素

++++++++++++++++等点电时的蛋白质（亲水胶体）带负电荷蛋白质（亲水胶体）脱水脱水脱水带负电荷蛋白质（疏水胶体）不稳定蛋白颗粒阴离子阳离子碱酸酸蛋白质聚集沉淀带正电荷蛋白质（亲水胶体）碱++水化膜带正电荷蛋白质（疏水胶体）（1）破坏水化膜，分子间易碰撞聚集，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化力，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失，使蛋白质分子因热运动碰撞聚集。（2）破坏水化膜，暴露出憎水区域,由于憎水区域间作用使蛋白质聚集而沉淀，憎水区域越多，越易沉淀。（3）中和电荷，减少静电斥力，中性盐加入蛋白质溶液后，蛋白质表面电荷大量被中和，静电斥力降导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。选用盐析用盐的几点考虑： 盐析作用要强盐析用盐需有较大的溶解度盐析用盐必须是惰性的来源丰富、经济3、中性盐的选择阴离子：

柠檬酸根-3>酒石酸根-3>F->I03->H2P04->S04->CH3C00->Cl->Cl03->Br->N03->Cl04->I->CNS-阳离子：

Th4+>Al3+>H+>Ba2+>Sr2+>Ca2+>Cs+>Rb+>NH4+>K+>Na+>Li+

Hofmeister对一系列离子沉淀蛋白质的能力进行排序，称Hofmeister序列，或感胶离子序。常用于蛋白质沉淀的盐为硫酸铵和硫酸钠。硫酸钠虽无腐蚀性但低于400C就不易溶解，因此只适用于热稳定性较好的蛋白质的沉淀过程。0℃20℃80℃100℃（NH4)2SO470.675.495.3103Na2SO44.918.943.342.2NaH2PO41.67.893.8101（1）溶解度大（2）分离效果好（3）不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用。（4）价格便宜，废液不污染环境。最常用的盐：硫酸铵缓冲能力弱，具腐蚀性，含N缺点优点（1）加入固体盐法4、盐析的操作方法适用：饱和度高，不增大溶液体积加入硫酸铵固体的量：查表、计算饱和度：

在给定条件下以可能达到的最大浓度的百分数表示的盐浓度。以硫酸铵为例：25℃时，硫酸铵的饱和溶解度是767g/L，定义为100%饱和度查表法查表时注意温度不同量的硫酸铵溶解时会引起溶液体积的变化计算法20℃25℃g：每升溶液加入固体硫酸铵的质量S2：所需达到的硫酸铵饱和度S1：原溶液的硫酸铵饱和度

（2）加入饱和溶液法适用：蛋白质溶液体积不大，所需调整的硫酸铵浓度不高。V：所需加入的饱和硫酸铵溶液的体积；V0：原溶液体积；S2：所需达到的硫酸铵饱和度；S1：原溶液的硫酸铵饱和度。饱和硫酸铵的配制方法在一定量的水中加入过量的硫酸铵，加热至50－60℃，趁热滤去沉淀，再在0℃或室温平衡1－2天，有固体析出时达100％饱和度。优点硫酸铵浓度变化连续，盐析效果较好。缺点硫酸铵饱和度的测定、计算工作手续繁琐，而且透析袋容积有限、盐析速度慢、硫酸铵耗费大。（3）透析平衡法方法一：取料液分成等体积几份，冷却至0℃5、盐析曲线的制作各级均离心分离沉淀物，将沉淀溶于2倍体积的缓冲液中，测定其中总蛋白和目标蛋白浓度（或测定离心上清液）以饱和度为横坐标，沉淀（或上清液）中总蛋白和目标蛋白浓度为纵坐标，得到蛋白质溶解度曲线蛋白质量(mg)或酶活力硫酸铵饱和度％蛋白质量(mg)或酶活力硫酸铵饱和度％方法二各级均离心分离沉淀物，将沉淀溶于2倍体积的缓冲液中，测定其中总蛋白和目标蛋白浓度以饱和度为横坐标，总蛋白和目标蛋白浓度为纵坐标，得到蛋白质溶解度曲线蛋白质量(mg)或酶活力硫酸铵饱和度％蛋白质量(mg)或酶活力硫酸铵饱和度％6、盐析的影响因素（1）离子强度与离子类型S：离子强度为I时蛋白质的溶解度；S0：离子强度为0时蛋白质的溶解度；KS：盐析常数。盐析时，蛋白质溶解度与中性盐的离子强度的关系：当溶剂的温度一定时，对于某一溶质，S0是一常数，β（溶解度常数）

Cohn方程KS越大，有效成分溶解度随盐浓度增加而减小的程度越大。KS越大，分级范围越小，盐析效果越好。多价阴离子具有很高的KS，但高价阳离子的存在反而降低KS

；大而不规则的蛋白分子KS越大。KS主要取决于盐的性质：离子价数离子半径介电常数KS几种盐的盐析能力的排列次序：磷酸钾>硫酸钠>磷酸铵>柠檬酸钠>硫酸镁1——纤维蛋白2——血红蛋白3——拟球蛋白4——血清蛋白5——肌红蛋白几种蛋白盐析时离子强度与溶解度的关系图例3.1

溶菌酶在2.8mol/L和3.0mol/L硫酸铵溶液中的溶解度分别为1.2g/L和0.26g/L，试计算在3.5mol/L硫酸铵溶液中的溶解度。5.68×10-3g/L例3.2

有100L蛋白质溶液，其中含牛血清蛋白BSA和另一种杂蛋白X，质量浓度分别为10g/L和5g/L。拟用硫酸铵沉淀法处理该溶液以回收沉淀中的BSA。20℃下BSA和X的Cohn方程参数列于下表（假设其他蛋白质的存在不影响方程参数），其中离子强度用硫酸铵浓度（mol/L）表示。（1）忽略溶液体积的变化，若回收90%的BSA，需要加入多少固体硫酸铵？（37.27Kg）（2）沉淀中BSA的纯度是多少？（95.34%）蛋白质βKsBSA21.67.65X20.06.85KS分段盐析法Β分段盐析法在一定pH、温度条件下，改变离子强度。适用于早期粗提阶段的分步分离。在一定离子强度下，改变pH、温度。适于后期分离纯化和精制。（2）蛋白质浓度硫酸铵盐析法测定羧基肌红蛋白：蛋白质浓度g/L硫酸铵饱和度%结果3058开始沉淀366开始沉淀306590%沉淀析出当蛋白浓度增加10倍时，盐析时所需硫酸铵的饱和度约减小7%。适宜蛋白质浓度是2.5％～3.0％（25mg/mL～30mg/mL）（3）pH的影响蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度就越大。改变pH值可改变蛋白质的带电性质，因而就改变了蛋白质的溶解度。远离等电点处溶解度大，在等电点处溶解度小，因此用中性盐沉淀蛋白质时，pH值常选在该蛋白质的等电点附近。在水或稀盐溶液中测得的等电点与在高盐溶液中测得的等电点结果可能不一样注意（4）温度的影响温度是影响溶解度的重要因素，对于多数无机盐和小分子有机物，温度升高溶解度加大。但对于蛋白质、酶和多肽等生物大分子，在高离子强度溶液中，温度升高，它们的溶解度反而减小。在低离子强度溶液或纯水中蛋白质的溶解度大多数还是随温度升高而增加的。

在一般情况下，对蛋白质盐析的温度要求不严格，可在室温下进行。但对于某些对温度敏感的酶，要求在0℃～4℃下操作，以避免活力丧失。

1）注意饱和度表中规定的温度；2）分段盐析中，应考虑每次分段后蛋白质浓度的变化；3）盐析后一般放置半小时至一小时，待沉淀完全后才过滤或离心；4）加入硫酸铵时应注意搅拌，避免局部过浓；5）硫酸铵使用前须用H2S处理，高浓度的硫酸铵溶液使用前需用氨水或硫酸调节至所需pH。

7、注意事项蛋白质等电点沉淀法是基于不同蛋白质离子具有不同等电点这一特性，依次改变溶液pH值的办法，将杂蛋白沉淀除去，最后获得目标产物。二、等电点沉淀法（1）适用于疏水性强的蛋白质（2）中性盐浓度增大时，等电点向偏酸方向移动，同时最低溶解度会有所增大。（3）无机酸通常价格便宜，无毒（4）蛋白质对低pH敏感，易失活未沉淀蛋白质的分率pH对大豆蛋白质溶解度的影响pH对白果碱提蛋白沉淀的影响利用等电点除杂蛋白时必须了解制备物对酸碱的稳定性，不然盲目使用十分危险。不少蛋白质与金属离子结合后，等电点会发生偏移，故溶液中含有金属离子时，必须注意调整PH值。由于许多蛋白质的等电点十分接近，而且带有水膜的蛋白质等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，单独使用此法分辨率较低，效果不理想。主要用于在分离纯化流程中去除杂蛋白例如：工业上生产胰岛素粗提液调PH8.0调PH3.0去除碱性蛋白质去除酸性蛋白质胰岛素三、有机溶剂沉淀法许多能与水互溶的有机溶剂如乙醇、丙酮、甲醇和乙腈，常用于低盐浓度下沉淀蛋白质。加入溶剂后会使水溶液的介电常数降低，而使蛋白质分子间的静电引力增大，导致凝集和沉淀。蛋白质的溶剂化，使原来和蛋白质结合的水被溶剂所取代，从而降低了它们的溶解度。有机溶剂可能破坏了蛋白质的某种键如氢键，使其空间结构发生某种程度的变化，致使一些原来包在内部的疏水基团暴露于表面并与有机溶剂的疏水基团结合形成疏水层，从而使蛋白质沉淀。机理分析进展对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在低温下进行。成本高。优点缺点①分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质或其他溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀。②沉淀不用脱盐，过滤比较容易（如有必要，可用透析袋脱有机溶剂）。2、有机溶剂的选择和浓度的计算不同有机溶剂沉淀蛋白质的效率受多方面的影响，需通过试验加以选择。大致上以丙酮最佳，乙醇次之，甲醇更次。

前提：能与水互溶V=需加入100％浓度有机溶剂的体积V0=原溶液体积S1=原溶液中有机溶剂的浓度S2=所要求达到的有机溶剂的浓度离子强度3、有机溶剂沉淀的影响因素温度样品浓度pH值有机溶剂必须预先冷至较低温度，操作要在冰盐浴中进行，加入有机溶剂时必须缓慢且不断搅拌以免局部过浓通常使用5mg/mL～20mg/mL的蛋白质初浓度样品稳定的pH值范围内，等电点附近通常溶液中盐浓度以不超过5％为宜四、非离子多聚物沉淀法

20世纪60年代非离子型聚合物开始用于分离血纤维蛋白原和免疫球蛋白，从此高相对分子质量非离子聚合物沉淀蛋白质的方法被广泛使用，如：聚乙二醇（PEG）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、葡聚糖等。①沉淀作用是聚合物与生物大分子发生共沉淀作用。②由于聚合物有较强的亲水性，使生物大分子脱水而发生沉淀。③聚合物与生物大分子之间以氢键相互作用形成复合物，在重力作用下形成沉淀析出。④通过空间位置排斥，使液体中生物大分子被迫挤聚在一起而发生沉淀。非离子多聚物沉淀蛋白的原理①操作条件温和，不易引起生物大分子变性。②沉淀效能高，使用很少量的PEG即可以沉淀相当多的生物大分子。③沉淀后有机聚合物较难去除。特点：1）选用两种水溶性非离子多聚物组成液液两相体系，不等量分配，而造成分离。2）选用一种水溶性非离子多聚物，使生物大分子在同一液相中，由于被排斥相互凝聚而沉淀析出。方法聚电解质是含有重复离子化基团的水溶性聚合物，可用于蛋白质沉淀的聚电解质有聚丙烯酸、聚乙烯亚胺、羧甲基纤维素和离子型多糖如肝素等。沉淀机理五、聚电解质沉淀法蛋白质分子的相反电荷与聚电解质结合，形成一个多分子络合物，当络合物超过游离蛋白质的溶解度极限值时，就发生沉淀。六、生成盐复合物沉淀法金属复合盐法有机盐法无机复合盐法能与羧基、胺基等含氮化合物以及含氮杂环化合物强烈结合的金属离子，如：Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+、Cd2+；能与羧酸结合而不与含氮化合物结合的金属离子，如：Ca2+、Ba2+、Mg2+、Pb2+；与巯基化合物强烈结合的金属离子，如：Hg2+、Ag+、Pb2+。金属离子沉淀蛋白质可分为三类：实际使用时，金属离子的浓度常为0.02mol/L。Zn2+沉淀尿激酶有机盐法无机复合盐法含氮有机酸如苦味酸、苦酮酸、鞣酸等能与有机分子的碱性功能团形成复合物而沉淀析出，沉淀后用乙醚除去有机酸。如细胞色素C用45%硫酸铵除杂后，用20%TCA即可将其沉淀。如磷钨酸盐、磷钼酸盐等。可加入乙醚或采用离子交换除去无机盐。七、其他沉淀法1、选择性变性法酸碱变性热变性表面活性剂变性有机溶剂变性选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白等杂质变性沉淀下来，而与目的物分开，这种分离方法就称为选择性变性沉淀法。变性过程符合一级动力学：用边界条件（c=c0，t=0）积分得：c：蛋白质浓度c0：蛋白质初始浓度t：时间kD：变性速率常数，用阿累尼乌斯方程Z：频率因子E：变性活化能R：气体常数T：热力学温度例3.3

热沉淀法处理两种酵母脱氢酶A和B的混合液，A和B的热变性速率常数分别为：试计算分别于20℃和50℃保温10min后A和B的活性残留率。2、亲和沉淀利用蛋白质与特定的生物或合成的分子之间高度专一的作用而设计出来的一种特殊选择性的分离技术，其沉淀原理是依据“吸附”有特殊蛋白质的聚合物的溶解度的大小。原理引导产生沉淀的方法有：离子交联加入带相反电荷的聚合物加入带相反电荷的疏水基团改变pH值，诱导产生疏水沉淀温度诱导产生沉淀配基-载体复合物与目的蛋白质的分离基本过程：亲和结合洗涤初始阶段：将一个目标蛋白质与键合在可溶性载体上的亲和配体络合成沉淀；所得沉淀物用一种适当的缓冲溶液进行洗涤，洗去可能存在的杂质用一种适当的试剂将目标蛋白质从配体中离解出来§3.4核酸的沉淀方法核酸分离纯化应维持在0-4℃的低温条件下，以防止核酸的变性和降解。为防止核酸酶引起的水解作用，可加入十二烷基硫酸钠(SDS)、乙二胺四乙酸(EDTA)、8-羟基喹啉、柠檬酸钠等以抑制核酸酶的活性。有机溶剂沉淀法等电点沉淀法钙盐沉淀法溶剂沉淀法常用的沉淀分离法有：1、有机溶剂沉淀法由于核酸都不溶于有机溶剂，所以可在核酸提取液中加入乙醇、异丙醇或2-乙氧基乙醇，使DNA或RNA沉淀下来。核酸沉淀的形状与其相对分子质量密切相关：相对分子质量>106Da的双链DNA可以丝状纤维缠绕在玻棒上；相对分子质量稍小的双链DNA或单链DNA、RNA则以凝胶形式存在。这些核酸经离心后存在于沉淀中，用70%乙醇洗涤，除去其它盐和小分子物质，干燥后即为核酸制品。2、等电点沉淀法脱氧核糖核蛋白的等电点为pH4.2；核糖核蛋白的等电点为pH2.0-2.5；tRNA的等电点为pH5。3、钙盐沉淀法核酸提取液10%氯化钙钙盐形式1/5体积的乙醇DNA钙盐沉淀4、选择性溶剂沉淀法①在核酸提取液中加入氯仿/异戊醇或氯仿/辛醇，振荡一段时间，使蛋白质在氯仿/水界面上形成凝胶状沉淀而离心除去，核酸仍留在水溶液中。②在对氨基水杨酸等阴离子化合物存在下，核酸的苯酚水溶液提取液中，DNA和RNA都进入水层，而蛋白质沉淀于苯酚层中被分离除去。③在DNA与RNA的混合液中，用异丙醇选择性地沉淀DNA而与留在溶液中的RNA分离。沉淀法应用利用蛋白质沉淀大规模提纯蛋白与免疫球蛋白的工艺柠檬酸的生产萃取