第二十章 卫生微生物的检验

第二十章

卫生微生物的检验卫生微生物检验的对象既包括病原微生物，也包括非致病和条件致病性微生物。标本的来源不仅局限于人体，也来源于空气、水、食品等。第一节水的卫生细菌学检验水的卫生细菌学检验主要包括细菌总数、总大肠菌群及粪肠球菌检测。细菌总数：每克（每毫升）检样在一定条件下（培养基成分、温度、时间、pH值、需氧性质等）培养后，得到1ml检样所含的细菌菌落总数。总大肠菌群：指一群经35℃24小时能发酵乳糖产酸产气、旭阳或兼性厌氧的革兰阴性无芽孢杆菌。粪肠球菌：是温血动物肠道内的正常菌丛。一般用粪大肠杆菌与粪肠球菌之比（FC/FS)作为判断粪便污染来源的指标。（大于4.1可认为污染来源于人体的粪便，小于0.7则来源于动物粪便。）水的卫生细菌学标准为：每毫升饮用水中，细菌总数不得超过100个，总大肠菌群数每升水中不得超过3个。（一）细菌总数测定菌落总数——需氧情况下，35℃培养48h，能在普通营养琼脂平板上生长的细菌菌落总数.作用：判定水体被细菌污染的程度基本操作一般包括：样品的稀释－－倾注平皿－－培养48小时－－计数报告。

三、水的细菌学检测1、样品的处理和稀释

操作要求：“无菌操作”贯彻始终。充分振摇或研磨25g或25ml检样225mL稀释液含有玻璃珠的灭菌玻璃瓶或乳钵1：10稀释液。1ml1ml1ml9ml稀释液1：1009ml稀释液1：10009ml稀释液1：10000减少误差：每递增稀释一次即换用1支1ml灭菌吸管，将吸管内液体沿管壁流入，勿使吸管尖端伸入稀释液内，并且稀释液应充分振摇。环境要求：琼脂平板在工作台暴露15分钟，每个平板不得超过15个菌落。

代表性：取固体样品时需多采几个部位，且经过均质或研磨；液体样品须经过振摇，以获得均匀稀释液。

2、稀释样品的取样和倾注平皿

每个稀释度做两个平皿将凉至46℃营养琼脂培养基注入平皿约15ml，并转动平皿，混合均匀。1.取样倾注平皿1：10稀释液225mL无菌水1mL1mL9mL稀释液1：1009mL稀释液1：10001mL1mL1mL1mL1mL1mL1ml无菌水25g或25ml检样3、培养及计数培养条件：倒置于36±1℃温箱内培养48±2h计数时间：到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于0－4℃，但不得超过24h。菌落总数报告方式

计平皿中菌落数：肉眼观察，必要时用放大镜检查。记下各平板的菌落总数，求出同稀释度的各平板平均菌落数。规律：不同稀释度的菌落数应与稀释倍数成反比（同一稀释度的二个平板的菌落数应基本接近），即稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。如出现逆反现象，则应视为检验中的差错（有的食品有时可能出现逆反现象，如酸性饮料等），不应作为检样计数报告的依据。报告原则菌落总数报告方式

例次不同稀释度的平均菌落数两个稀释度菌落数之比菌落数(个/mL)报告方式(个/mL)10-110-210-31136516420—22760295461.632890271602.24无法计数4650513—527115—6无法计数30512—7无法计数无法计数无法计数164001.6×104377503.8×104271002.7×1045130005.1×1052702.7×102305003.1×10410-3无法计数菌落总数报告方式

计数原则：选平均菌落数在30~300之间者进行计算2.若有2个稀释度的平均菌落数在30~300之间时，则按两者的菌落总数之比来决定，若比值小于2应报告两者的平均数；若大于2则报告其中较小的菌落总数。3.若所有稀释度的平均菌落数均大于300，以稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。4.若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。5.若所有稀释度的平均菌落数均不在30~300之间，则以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。6.若所有的菌落数匀为“无法计数”时，应注明水样的最大稀释倍数。1.仅1个稀释度的平均菌落数在此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数报告之。7.在求同稀释度的平均数时，若其中1个平板上有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌落约为平板的一半，而另一半平板上菌落分布很均匀，则可按半平板上的菌落计数，然后乘以2作为整个平板的菌落数。4、菌落总数报告方式

菌落数的报告，按国家标准方法规定菌落数在1~100时，按实有数字报告，如大于100时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算。为了缩短数字后面的零位，可用10的指数来表示。

固体检样以克（g)为单位报告，液体检样以毫升（mL）为单位报告，表面涂擦则以平方厘米（cm2）报告。(二)大肠菌群测定

——国家标准采用三步法

1、检验查表方法

大肠菌群

——需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。

乳糖发酵试验分离培养证实试验样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。36±1℃培养48±2h，观察是否产气。将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上，36±1℃培养18-24h，观察菌落形态。挑取平板上的可疑菌落，进行革兰氏染色观察。同时接种乳糖发酵管36±1℃培养24±2h，观察产气情况。

根据证实为大肠杆菌阳性的管数，查MPN表，报告每100ml（g）大肠菌群的MPN值。

较清洁样品的三步法图示

100mL50mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液100mL5mL5mL5mL5mL5mL5mL5mL5mL5mL5mL水样10mL10mL10mL10mL10mL10mL10mL10mL10mL10mL三步法图示

取产酸产气的发酵管中培养液在伊红美兰平板上进行划线取有核心和带金属光泽的深紫色菌落进行革兰氏染色乳糖蛋白胨培养液镜检（革兰氏阴性菌）37℃培养48h证实产气（阳性）结果与否37℃培养24h37℃培养24h

大肠菌群测定

2、计算方法

挑选菌落特征：黑紫色、有光泽或无光泽菌落；红色、粉红色菌落。抑制剂：胆盐、煌绿、十二烷基硫酸钠。

为阴性结果的水样体积（mL）×全部水样体积（mL）

MPN＝

1000×为阳性结果的发酵管（瓶）的数目

产酸判断：紫色培养液变成黄色产气判断：发酵导管内有小气泡，如轻轻打动试管有气泡沿管壁上浮，应考虑可能有气体产生，需进一步试验。第二节食品的微生物学检验食品营养丰富易于微生物的生长。食品的变质可分为腐败和酸败。腐败是指食品中的蛋白质被微生物分解引起的变质败坏。酸败是指食品中的脂肪或碳水化合物被微生物分解引起的变质败坏。样品的采集食品微生物检验采集的样品种类有大样、中样及小样三种。大样是指一整批样品；中样是指从样品中各不同部分采取的混合标本，一般以200g为准；小样又叫检样，是供分析用的样品，一般以25g为准。菌落总数的检验菌落总数是判定食品被污染程度的指标，也可观察细菌在食品中繁殖的动态，为被检样品的卫生学评价提供依据。1.检样的处理与稀释2.倾注培养3.菌落计数及报告计数平板内菌落数目，乘以稀释倍数，即为每克（或每毫克）样品所含菌落总数。大肠菌群的检验1.检样稀释2.乳糖发酵实验将待检样品接种在乳糖胆盐发酵管内，置35℃恒温箱内培养24小时，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产气者，进行下述实验。3.分离培养将上述培养物转种在伊红美蓝琼脂平板上置35℃恒温箱内培养10-24小时，观察菌落形态，作革兰染色和证实实验。4.证实实验挑取可疑大肠菌群菌落进行革兰染色，同时接种乳糖发酵管，置35℃恒温箱内培养24小时，观察产气情况，凡分解乳糖产气、革兰染色阴性的无芽孢杆菌，即报告为大肠菌群阳性。5.报告粪大肠菌群的检验用提高培养温度的方法，将自然环境中的大肠菌群与粪便中的大肠菌群区分开，在44.5℃仍能生长的大肠菌群，称为粪大肠菌群。1.44℃乳糖发酵试验2.分离培养3.证实试验在蛋白胨水内加入靛基质试剂，若靛基质试验阳性，则证实为粪大肠菌群。4.报告细菌性食物中毒的检验细菌性食物中毒是指食用含大量细菌和（或）细菌毒素所污染的食物而发生的中毒。细菌性食物中毒发病急、病程短，不进食者不发病。（一）样品的采集与处理（二）检验1.直接涂片2.活菌数的测定3.分离培养：需氧、厌氧4.动物试验5.血清学试验：急性期和恢复期的血清作凝集试验（三）常见食物中毒的细菌学检验1.沙门菌属食物中毒的检验2.大肠埃希菌食物中毒的