北京地区实验动物微生物、寄生虫和遗传质量检测结果分析

北京地区实验动物微生物、寄生虫和遗传质量检测结果分析

生物实验研究的四个因素（anima、pretel、信息、resour，简称aeir）在所有实验研究中发挥着重要作用。然而，事实上，实验动物的质量往往是一个因素，它会影响整个实验的质量和水平。根据携带的微生物和寄生虫的程度不同,可以分为普通级动物(conventionalanimals,CV)、清洁级实验动物(cleananimals,CL)、无特定病原体动物(specificpathogenanimals,SPF)、无菌动物(germfreeanimals,GF)。从遗传学的角度,可以分为近交系(inbred)、封闭群(outbred)和杂交群等。不同的实验动物生产条件和成本不同,应用的实验范围也不同。按照国家标准规定,需要对生产的实验动物进行定期检测,从而保证为用户提供质量合格的动物,以保证实验数据的准确性和重复性,为生物医药产业发展和生命科学研究奠定基础和提供保障。北京市实验动物质量监督抽检是由北京市实验动物管理办公室依据《中华人民共和国动物防疫法》、《实验动物质量管理办法》、《实验动物许可证管理办法》、《北京市实验动物管理条例》、《北京市实验动物许可证管理办法》、《北京市实验动物质量检测工作管理办法》等相关法律法规,对北京地区具有实验动物生产许可证的企业单位进行一年两次的抽样,并委托具有检测资质的单位进行法定检验并出具检验报告,及时发布质量抽检信息,对不合格的动物及时进行处理,维护首都实验动物质量安全。本文对5年来北京地区实验动物质量抽检结果进行分析,探讨影响动物质量的因素,为生产单位进行质量管理提供参考。1材料和方法1.1材料表面被检的实验动物均来自北京地区具有《实验动物生产许可证》且规模较大的实验动物生产单位。各年度抽检单位数量、动物品种等级及数量详见表1。1.2抽样数量及抽样频率北京市实验动物管理办公室依法对北京地区具备资质的实验动物生产单位进行抽样,各品种各项目的抽样数量均参照国家及地方标准总则的规定。样品交由具备实验动物质检资质的检测机构,依据国家及地方标准进行检测,检测方法、检测仪器和试剂均参照国家及地方标准要求配备。1.3分析检验报告按照相应的国家标准及地方标准,对检测结果进行综合判定,并由检测单位出具检验报告。依据各年度的检验报告,进行5年间SPF级、清洁级、普通级病原感染的情况进行分类统计、免疫抗体不合格比例统计和遗传质量不合格批次统计,并进行各年度病原感染率统计和批次合格率统计,各比率均以百分率计。2结果2.15嗜肺巴斯德杆菌检测从表2可见,SPF级动物中检出了嗜肺巴斯德杆菌、小鼠肝炎病毒抗体、大鼠细小病毒抗体、鞭毛虫和蠕虫。其中,小鼠在2009年和2013年两年都检出嗜肺巴斯德杆菌阳性;2012年小鼠检出了肝炎病毒抗体阳性(阳性率为1.4%),大鼠检出了细小病毒抗体阳性(阳性率为25%)。鞭毛虫和蠕虫都只在2013年检出,检出率都未超过10%。2012年和2013年还抽检过两批次豚鼠共15只,均未检出SPF级动物应排除的微生物和寄生虫,因此未列入表2。2.25大小鼠血药浓度与健康指标的相关性表12009-2013年,清洁级动物中检测出了泰泽病原体、绿脓杆菌、支原体、仙台病毒抗体和蠕虫,详见表3。其中豚鼠仅在2013年检出了蠕虫(阳性率为40.0%)。2010年清洁级大小鼠均检出泰泽病原体,阳性率均小于2.0%;2011年两者均检出了绿脓杆菌,小鼠阳性率为6.7%,大鼠为20.0%。2012年仅在清洁级小鼠中检出支原体(阳性率0.7%)和仙台病毒抗体(1.3%)。2.35免疫抗体检测结果普通级实验动物的病原体感染情况如表4所示。豚鼠、犬、猴均检测出弓形虫阳性,其中豚鼠连续五年都有感染,阳性率成折线形发展。猴B病毒在2009年、2011年和2012年均检出阳性,阳性率分别为50.0%、20.0%和35.0%。2009年还检出犬布氏杆菌阳性(阳性率为3.2%),猴B病毒抗体阳性(阳性率为50.0%);2011年检出豚鼠中淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒抗体阳性(阳性率为1.4%);2013年豚鼠和兔均检出体外寄生虫阳性,阳性率分别为5.3%和0.4%。5年来,在普通级动物中均检出有免疫抗体不达标的情况,其变化趋势可见文后彩版Ⅰ-图1。其中兔出血症病毒免疫不达标在5年中均存在,2011年最高,达到24.3%。犬温热病毒免疫不达标情况从2010年起连续存在4年,2012年最高达到58.1%。2013年还出现了犬瘟热病毒、犬肝炎病毒和狂犬病病毒免疫均不达标的情况。另外,实验用小型猪为2013年下半年新增检测品种,检测了两批次10份样品,总体免疫水平都不高,猪繁殖与呼吸综合征病毒以及乙型脑炎病毒无一达标,口蹄疫病毒、猪瘟病毒免疫合格率也没有达到标准要求。2.45交系小鼠遗传质量检测结果5年中共送检了40批次的近交系小鼠和2批次近交系大鼠(LEW和WKY,2013年),但近交系大鼠只申请了微生物和寄生虫等级监测,没有申请遗传质量检测。故表5中仅列出了近交系小鼠遗传生化标记和H-2单倍型监测的结果。2010年和2013年各有1批次C57BL/6J-ly5.1小鼠出现了不同程度的位点杂合,2013年另有一批次C57BL/6小鼠中的1只在酯酶-3位点发生了变异。2.5小鼠体内病毒抗体检测由于免疫抗体不达标情况主要集中在普通级动物中,文后彩版Ⅰ-图2仅显示了2009年-2013年不同微生物、寄生虫等病原各年度感染阳性检出结果的趋势图。5年中共检出15种病原体感染,其中10种为人兽共患病病原体:即绿脓杆菌、嗜肺巴斯德杆菌、布氏杆菌、支原体、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒和猴B病毒。体外寄生虫有弓形虫、蠕虫和鞭毛虫。年度检测状况比较,2009年和2010年病原感染均检出3项,分别为犬布氏杆菌和猴B病毒、弓形虫和嗜肺巴斯德杆菌、泰泽病原体、弓形虫。2012年检出了支原体、皮肤病原真菌、小鼠肝炎病毒、大鼠细小病毒、仙台病毒、猴B病毒和弓形虫等7项病原感染,位居各年病原感染之首,且为5年中唯一一年在SPF级大小鼠中均检测到人畜共患病毒抗体。2013年除在SPF级小鼠中检测到嗜肺巴斯德杆菌阳性,其余四项均为寄生虫(体外寄生虫、弓形虫、蠕虫、鞭毛虫)感染,且除弓形虫以外的三项寄生虫感染均只在2013年有检出。2.65动物检出量和检疫批次从表6中可见,除2009年送检单位为16家,此后每年送检单位均在20家以上,2013年多达28家。抽检动物数量自2009年的695只增长为2013年的900只,增幅达到了29.5%。抽检批次从78批增至112批,逐年递增。批次合格率由89.7%下降为68.8%,其中免疫不达标成为了2010年以后批次合格率下降的主要原因。3实验动物质量检测的现状实验动物质量监测是实验动物科学的重要内容,是确保实验动物质量的必要手段,经过监测合格的实验动物才能保证动物实验结果准确性、规律性、重复性。同时,这也是实验工作人员健康和生命的保证[9—11]。通过合理的质量检测,能够排除实验动物易携带的人畜共患病原体(如流行性出血热、狂犬病、猴B病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒、弓形虫等),从而减少实验动物在饲养、销售和使用等环节对人群的感染。对于生产单位而言,动物质量检测更是企业盈利和良性发展以及动物生产和繁殖的保证。动物质量容易受到气候、饲养环境、饲料、饲养及繁育方式、人员、运输等多种因素的影响。监测的缺失将直接导致管理和生产的盲区,实验动物一旦染上传染病,则种群难以净化,一些烈性传染病如鼠痘、兔病毒性出血症等可致动物全军覆没,造成巨大经济损失。回顾北京地区2009-2013年实验动物质量检测情况,不难发现5年间北京地区实验动物抽检的参检单位数量、实验动物数量、实验动物品种均呈上升趋势,而检测的批次合格率则呈下降趋势。这其中有新增单位和动物品种的因素,有某单位某时段某批次动物的偶发问题,也有常年检测持续存在的病患(如弓形虫、猴B病毒)等。这固然反映了动物生产单位在生产和管理过程中的漏洞,但同时也为监管和检测提出了新的课题。3.1加强质量监督和反馈,提高管理效率行业监管对于规范和推动实验动物科学发展具有十分重要的作用,但是如果过于体制化、模式固定,也就很难将监测做到公正、及时、有效。如何避免实验动物质量波动问题的此消彼长并使其得到有效的控制,需要监管部门在抽检及结果处理方式上做出更科学合理的安排。北京市的实验动物质量监督抽检基本在每年的5月和10月集中进行,时间和方式多年约定俗成,一些生产企业难免会因为应付监测而在抽检之前有所准备。为使待检单位站在同一个监测基线,应当在可能的条件下增加随机抽检和盲检的次数,确保监督抽检的公平性和灵活性;同时,对不合格的动物及生产厂家建立跟踪档案,做好反馈和质量示踪;同时,也要加大信息资源平台的建设,加强信息发布,使法制监管更加的公开和透明。随着实验动物标准化的进程和实验动物资源品种的日益丰富,要求实验动物的监测必须随之发展,才能满足生产企业和用户市场的需求。2013年下半年,实验用小型猪的微生物和寄生虫等级监测已纳入法定监督抽检中,这正是上述变化的一个体现。对于新增品种,监管部门就应当做出及时的反应,委托有资质的检测机构开展新品种的质量监测。多年来微生物和寄生虫等级监测受到了监管部门和生产厂家的重视,5年共送检了459批次。而在遗传监测上,只有BALB/c,C57BL/6等少数几个近交系小鼠纳入了监测范围,虽有近交系大鼠送检,也只申请了微生物和寄生虫等级检测。封闭群实验动物的遗传质量检测就更为落后,这其中除了发展标准监测方法困难的因素外,监测导向的缺位也是遗传质量评价多年缺乏变化的重要原因。实验动物的遗传背景决定了其反应特性,只有做好遗传质量监测,才能充分保障种群的特异性。很多生产企业遗传质量控制意识淡薄,也很难建立遗传检测的条件,一旦发生遗传变异,对于企业更是巨大的损失[13—15]。这就更需要监管机构加大遗传检测的力度,保障实验动物的质量。3.2检测标准修订5年监测共检出绿脓杆菌等15项病原感染(图2),其中有10项均为人兽共患病病原体。普通级动物所检测的8项免疫不达标项目(图1)对应的病毒也均为人兽共患病病毒,一旦发生感染后果不堪设想。实验动物检测人员作为密切接触动物和动物实验的工作人员,必须要加强生物安全意识,务必按照检测标准要求,在符合条件的实验室进行检测及处置,保障自身和环境的安全,保障检测工作的顺利进行。检测标准一方面是检测的依据,另一方面也需要检测人员在工作中不断改进和更新。自2008年以来,实验动物微生物、遗传检测国家标准均有不同程度的变更。在微生物等级检测中,去掉了单核李斯特杆菌;遗传检测中则增加了肽酶-3的生化标记位点。单核李斯特杆菌为人兽共患病病原体,去掉此检测项目是否科学有待商榷。增加了肽酶-3位点检测,在遗传质量评价中起到何种作用也需要更多数据支撑。美国、日本、欧盟、ICLAS在实验动物质量监测中所使用的新方法(如分子生物学方法、基因测序、芯片技术、PRIA———PCR啮齿类感染媒介检测技术等[17—20])是否能够适应我国的检测需要,有待检测人员不断的探索、总结和思考,从而提升自身的检测技能,改进检测方法,合理使用动物并提高检测效率,助推实验动物检测的标准化进程。3.3质量监督检验动物抽检数量的增加反映了动物生产数量和品种的增加。在总体的增长中,犬和猴的数量基本没有变化,普通级豚鼠、兔以及SPF级的大小鼠的数量逐年上升,清洁级大小鼠的数量呈下降趋势,清洁以上级别的豚鼠和兔则数量很少。同时,各年度的批次合格率也呈下降趋势。实验动物的质量容易受到环境设施、理化因素、饲养方式、繁育运输等多种因素的影响。任何一个环节出现疏漏,都有可能造成质量不合格,从而带来经济损失。减少生产环节中的失误,必须强化饲育人员的责任心及繁育技术的普及,提高生产管理的水平。随着生物医学的发展,对SPF级以及更高级别实验