第二章 一般组织化学技术

标本制备技术:组织化学的基本要求：保持组织细胞良好的形态结构。具备高度的特异性。应有一定的灵敏性。4.可重复性。5.生物反映的产物必须在原位沉淀、色深、不溶和具有稳定性的特点。组织切片技术:

（一）冰冻切片：速冻：干冰—丙酮（酒精）法：

液氮法：2.蔗糖浸泡法：（二）石蜡切片：是经典而最常用的技术。步骤：共5大步骤：

①取材→→②固定→→③脱水→→

④浸蜡、包埋→→⑤切片

玻片处理和涂胶：

（三）振动切片：（四）塑料切片：（五）超薄切片：用于电镜组织化学。（六）碳蜡切片：组织化学的基本程序一、选题：

确定研究对象（内容）。依据前期研究和文献资料。二、选方法：原则：

应尽量简单，特异性和灵敏度高，易得结果，结果可靠性强。三、准备阶段：1.试剂、药品:2.动物:3.实验（模型）:4.标本制备（备用）:四、组织化学反应：五、观察、记录及结果统计分析：六、查文献写论文：

一般组织化学技术一、酶组织化学（一）基本概念及分类特点：①酶蛋白是大分子，而一般催化剂为小分子。②酶具有高效的催化能力，其催化效能比一般催化剂高很多倍。③酶催化反应条件温和，近中性和常温下即可发生酶催化反应。④酶对催化的底物具有高度的专一性。⑤酶分子结构多种多样，其活性受体内多种因素的调控

分为六类：

a.氧化还原酶类：b.转移酶类：

c.水解酶类：

d.裂合酶类：e.异构酶类：f.合成酶类:（二）酶的保存及影响酶催化反应的因素1.酶浓度的影响：2.底物浓度的影响：3.激活剂浓度的影响：抑制剂的影响：

根据抑制剂对酶的抑制作用不同：不可逆性抑制：可逆性抑制：竞争性抑制：非竞争性抑制：反竞争性抑制：5.PH值对反应的影响：最适PH值常表现于三个方面：

一是对Vmacr反应速度的影响。二是对Km或对底物与酶的亲和性的影响。三是对酶稳定性的影响。

确定最适PH的方法：

一是查阅文献，根据前人的经验，预实验印证（碱性磷酸酶9.2，酸性磷酸酶5.0）。

二是实验测定最适PH值。6.温度的影响:一是温度能影响酶分子结构的稳定性及其与底物分子之间的亲和性。

二是温度能影响酶底物复合物分解速度。三是温度能影响激动剂或抑制亲和性。（三）显示酶的组化方法及原理在酶的显示方法中，从原理讲，可分两大类：一类是显示酶的活性—酶组织化学方法：属于一般组化方法。二类是显示酶的本质，即酶蛋白的存在及存在部位—免疫酶组织化学。

在酶组织化学中，根据其反应原则，显示酶的方法，可分为两类：1.沉淀反应法：

主要用于显示分解酶类。

又分两类：

①金属阳离子沉淀法：S→生成物中有基团+金属离子结合→沉淀（有色）。

②偶联偶氮沉淀反应法：S→生成物中有基团+重氮盐→不溶的有色沉淀（偶氮染料）。

2.电子传递法：主要显示氧化酶和脱氢酶。（四）组化中常用的酶类

1.标准和要求:（1）酶的纯度较高，容易获得且价格低廉。（2）当酶与抗体或抗生物素蛋白结合后，酶的活性不变。（3）结合后的酶分子在液相中能保持稳定。（4）内源性酶的活性应受到最大限度的降低，使之不能干扰与特异性抗原相关的染色过程。（5）酶反应的产物性质稳定，容易被检测。

2.常用酶：（1）辣根过氧化物酶（HRP）：常用HRP标记抗体。显色原有：

①DAB：

H2O2→H2O+O→+DAB→原位棕黄色沉淀。②AEC：氧化后玫瑰红色沉淀，易溶于醇。③CN：氧化后蓝色沉淀，易溶于醇及有机溶剂，且易扩散。④H-Y试剂：氧化后蓝黑色沉淀。（2）小牛肠碱性磷酸酶（CIAP）：显色原有：①固红TR：产物呈鲜红色。固蓝BB：产物呈亮蓝色。均易溶于醇和有机溶剂，故及时处理切片。

②新碱性品红（NF）：产物呈红色,不易溶于醇和有机溶剂，其显色强度高于固红TR和固蓝BB。（3）葡萄糖氧化酶（尼腺曲霉菌素源）常用的显色原有：①2-P-碘酚-3-P-硝基苯-5-酚氯化四氮唑（INT）：产物呈红色，易溶于有机溶剂。②氮蓝四唑（NBT）：产物呈蓝黑色。现用于双重染色。③四硝基氮蓝四唑（TNBT）：产产物呈灰褐色，不溶于有机溶剂。（4）β-半乳糖苷酶（大肠杆菌来源）5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷，产物呈靛蓝色沉淀。

最常用的酶为HRP。

（五）常见酶组织化学技术（自学）二、糖组织化学技术（一）概述：一般分四类：1.多糖：2.粘液物质：3.糖蛋白：4.粘液脂类：（二）显示方法：

PAS反应：过碘酸雪夫（Schiff）氏法。反应产物呈紫色沉淀。在反应中，特别注意PH和温度。此外HI04还能氧化其它基团：α-氨基醛、酮类、丝氨酸、α-氨基醇等。三、核酸组织化学技术（一）概述：

（二）显示方法：1.福尔根（Feulgen）显示DNA法：2.其它方法自学。

四、蛋白质组织化学五、荧光组织化学（一）概述：（二）分类：

1.自发荧光：2.诱发荧光：（1）甲