发育毒性和致畸作用

第九章发育毒性与致畸作用掌握致畸实验的实验设计、程序、评价。熟悉致畸作用的毒理学特点；致畸物的评价与分级；发育毒性体外实验。理解致畸作用的机制。重点：致畸实验的实验设计、程序、评价。难点：致畸实验的实验设计。教学提纲：1.概述：（1）发育毒理学。（2）从畸胎学到发育毒理学。2．发育毒性与致畸性：（1）基本概念和发育毒性的终点。（2）发育各阶段发育毒性作用的特点。（3）母体毒性与发育毒性。（4）发育毒性的剂量-反映模式和阈值的概念3．致畸（发育毒性）作用机制。4．发育毒性和致畸作用实验与评价:（1）动物发育毒性实验。（2）流行病学研究和人类的证据（3）发育毒性的替代实验。概述发育毒理学（developmentaltoxicology）重要研究外源化学物对胚胎发育、胎仔发育以及出生幼仔发育的影响及其评定，评定办法称为发育毒性实验，其中重要为致畸实验。从畸胎学到发育毒理学外源化学物或其它环境因素与机体接触后，能够干扰生殖发育的任何环节，并造成损害作用。另外，哺乳动物的性激素对生殖发育过程也含有调节作用，正常的生殖发育必须在激素调节作用下完毕。因另外源化学物，首先直接作用于生殖发育过程，同时又能够通过对内分泌系统，特别是对性腺的作用，发生间接的影响。例如，男性的睾丸萎缩和多个形式的性机能减退，女性可出现痛经、月经紊乱，甚至闭经。卵细胞的受精过程也可受到某些外源化学物的干扰，出现不孕症。另外，神经系统对内分泌功效也有调节作用，因而也可间接影响性腺功效以及生殖发育过程，即通过下丘脑-垂体-睾丸轴或下丘脑-垂体-卵巢轴两条途径作用于生殖发育过程。有些外源化学物与机体接触后，还能够引发多个类型的形态和构造的异常。例如，正在发育中的精细胞能够出现形态畸形或数目变化，而畸形的精子往往也含有功效缺点。卵细胞受到外源化学物的损害作用后，能够出现死亡或影响其正常受精过程，有时即使能受精，也可能出现胚胎死亡，有些胚胎即使能存活，其正常发育也受到干扰，以致胎仔（儿）出现外观或功效异常。外观的异常普通称为畸形（malformation）。它是外源化学物干扰正常生育繁殖过程的一种体现，称为致畸作用（teratogenic）。发育毒理学是在畸胎学基础上发展起来的毒理学分支学科。但是，畸胎学，或出生构造缺点的研究，作为一种描述性的科学在有文字之前就已经存在了。四大文明古国都有畸胎的记载，最早能够追溯到6500D.B.。那时人们相信异常的婴儿是上天的处罚、星象的反映和将来的预兆，或者是人和动物之间杂交的成果。随着16、17世纪生物科学的兴旺发展，willianharvy于1651年提出了畸形起因于器官或构造的不完全发育的发育障碍学说，来解释除遗传来源以外的历有畸形。当代实验畸胎学开始于19世纪初，许多19和20世纪的胚胎学家，使用多个不同的物理(震动，倒置，针刺)和化学因素解决鸡蛋，产生了畸形小鸡，重要的是，他们注意到作用时间在决定畸形类型方面比损伤的性质更重要。反映停(thalidomide)，20世纪60年代前后在欧洲和日本广泛作为安全有效的抗早孕反映药品，口服剂量50—200mg／d。1961~1962年，联邦德国的儿科病房中出现了大量罕见的短肢畸形儿，多数为四肢缺点、无眼、腭裂、骨骼发育不全、十二指肠和肛门闭锁。同一时期，全球出现了5850个短胶畸形儿。McBride和Lenz在德国和澳洲的独立研究，均确认反映停是其因素。反血停被迫从市场撤回，动物模型复制成功。其致畸剂量相称于1mg／(kg.d)，只要末次月经后6~8周内口服200mg反映停便可引发严重的短肢畸形；服药妇女尚有流产、早产和死胎等发生。反映停事件是人类历史上的一种悲剧。但由此，增进了化学致畸的研究以及管理法规的建立。在许多国家中，管理机构开始发展动物测试办法并与慢性毒性研究分开，以评定药品对妊娠的影响。1966年美国FDA提出了三段生殖毒性实验指南，涉及对致畸等发育毒性的评价。但是，尽管早就提出了发育毒性的四大致现，实际研究中仍将注意力放在致畸作用上，而无视了对其它发育毒性的评价。直到20世纪80年代后期美国环保局(EPA)提出可疑发育毒物危险度评价指南，第一次明确提出了对发育毒性的评价。我国每年有30—40万患严重的、肉眼可识别的先天缺点的新生儿出生，其中很大比例在一年内死亡。先天畸形占围生期死亡因素的第二、第三位。先天缺点造成寿命缩短是肿瘤和心血管疾病的8倍和5倍发育毒性与致畸性发育毒理学(developmentaltoxicology)是毒理学的重要分支学科，研究发育生物体在受精卵、妊娠期、出生后、直到性成熟的发育过程中，由于出生前接触造成异常发育的理化因素或环境条件后的发病机制和成果。一、基本概念发育毒性(developmentaltoxicity)指出生前经父体和(或)母体接触外源性理化因素引发的在子代达成成体之前内出现的有害作用，涉及：构造畸形、生长缓慢、功效障碍及死亡。能造成发育毒性的物质称为发育毒物(developmentaltoxicant)。发育毒物应是在未诱发母体毒性的剂量下产生发育毒性的物质。某些外源化学物可干扰胚胎以及胎儿的发育过程，影响正常发育。具体体现可分为：1、生长缓慢：即胚胎与胎仔的发育过程在外源化学物影响下，较正常的发育过程缓慢。2、致畸作用(teratogeniceffect)：由于外源化学物干扰，活产胎仔胎儿出生时，某种器官体现形态构造异常。致畸作用所体现的形态构造异常，在出生后立刻可被发现。3、功效不全或异常：即胎仔的生化、生理、代谢、免疫、神经活动及行为的缺点或异常。功效不全或异常往往在出生后一定时间才被发现，由于正常状况下，有些功效在出生后一定时间才发育完全。4、胚胎或胎仔致死作用：某些外源化学物在一定剂量范畴内，可在胚胎或胎仔发育期间对胚胎或胎仔含有损害作用，并使其死亡。具体体现为天然流产或死产、死胎率增加。在普通状况下，引发胚胎或胎仔死亡的剂量较致畸作用的剂量为高，而造成发育缓慢的剂量往往低于胚胎毒性作用剂量，但高于致畸作用的剂量。以上四种发育毒性的具体体现并非一定在一种外源化学物作用下同时出现，有时只出现其中的一种或一部分。另外，有些外源化学物通过胎盘与发育中的胚胎或胎仔接触，还能够引发子代肿瘤发生率增高。致畸作用是外源化学物发育毒性的一种具体体现，对存活后裔机体影响较为严重，往往是一种不可逆过程，含有重要的毒理学意义，本节也将以致畸作用为重点，进行讨论。畸形(malformation)：器官形态的异常。变异(variation)：集体的形态构造或生理功效，在同一物种的子代与亲代之间或子代的个体之间，有时出现不完全相似的现象，即为变异。畸胎(terate)：含有畸形的胚胎或胎仔。致畸物或致畸原(teratogen)：凡在一定剂量下，能通过母体对胚胎或胎儿正常发育过程造成干扰，使子代出生后含有畸形的化合物。致畸实验：评定外源化学物与否含有致畸作用的实验。畸形时胚胎或胎儿的某些细胞在生长发育的最敏感阶段受损的成果。致畸作用是外源化学物毒性作用的一种体现。先天性畸形并非一定含有遗传性，并且大多数先天畸形并不含有遗传性，但也确有一部分先天性畸形含有遗传性，可传给后裔。凡由于外源化学物损伤生殖细胞所引发的先天性缺点或异常，含有遗传性，可有亲代动物遗传给子代。如果此种损害仅涉及体细胞，与生殖无关，则所引发的先天畸形不含有遗传性。根据现在致畸实验的概念和办法，涉及范畴仅限于体细胞受损所引发的畸形，即外源化学物干扰胚胎器官形成过程的成果。除外源化学物含有致畸作用外，其它物理因素（如放射线）和生物因素（如风疹病毒）也可引发胎儿畸形。现在在毒理学中，重要以化学物的致畸作用作为研究对象。胚胎毒性作用(embryotoxicity)外源化学物引发的胎仔生长发育缓慢和功效缺点不全的损害作用。其中不涉及致畸和胚胎致死作用。二、发育各阶段发育毒性作用特点器官发生期的胚胎对致畸物最为敏感含有发育毒性的外来化合物与发育中的胚胎或胎仔接触，可因胚胎或胎仔所处的发育阶段不同而呈现不同的敏感性。有性生殖动物由受精卵发育成为成熟个体的过程，可概括为胚泡形成、着床、器官发生、胎儿发育以及新生儿发育等阶段。着床前的胚胎对胚胎致死作用较为易感，对致畸作用并不如此。在胚胎发育后期和新生儿期，最容易体现的发育毒性是生长缓慢和神经、内分泌以及免疫系统机能的变化。胎仔或胎儿对胚胎致死作用的易感性虽较胚胎为低，但仍有一定数目的死产胎发生。在致畸作用中，对致畸物最敏感的阶段是器官发生期，普通称为危险期或核心期。在惯用实验动物中，自受精日计算，大鼠器官发生期约为9～17天，小鼠器官发生期为7.5～16天，家兔为11～20天。在器官发生期中，致畸物与胚胎接触可能造成形态构造异常，但如在着床前胚泡形成阶段接触致畸物，则往往出现胚胎死亡，畸形极少。大鼠着床前胚泡形成期，自受精日计算，约为3～4天，开始着床日约为5.5～6天；小鼠分别为3～4天和4.5～5天；家兔分别为3～4天和7天。同一剂量的一种致畸物在敏感期中与胚胎接触，可因胚胎所处发育阶段不同而出现不同的畸形。例如，以20mg/kg体重剂量环磷酰胺在受精后第8～12天期间，每日分别予以小鼠，即使畸形多出现于前肢趾部，但畸形种类，则可因予以的日期不同而分别为多趾，并趾，缺趾和无趾。如将大量维生素A在受精后第8天予以大鼠，重要出现骨骼畸形；如在第12天予以，则诱发腭裂。同样剂量砷酸钠在小鼠受精第7天和第9天分别予以，前者重要出现脐疝，后者重要为露脑。发育中的胚胎对致畸作用的敏感期即使重要在器官发生期，但在此期间，多个不同器官还各有特别敏感的时间。大鼠器官发生期为受精后9～17天，但眼的最敏感期为受孕后9天，心脏和主动脉弓约为9～10天之间，脑约为10天，头与脊椎骨约为11天，腭为12～13天，泌尿生殖器官约为15天。三、母体毒性与发育毒性母体毒性(maternaltoxicity)是指外源化学物在一定剂量下，对受孕母体产生的损害作用。具体体现涉及体重减轻、出现某些临床症伏、直至死亡。母体毒性作用可分为轻度和严重母体中毒。轻度母体中毒的体现应限于母体体重下降，正常增加受到克制。克制程度，不超出不接触受试物对照组动物的10%。肝重可略有增加，但生殖机能正常；严重母体中毒可出现体重增加大幅度克制、持久性呕吐、过分安静或活动过分、呼吸困难、生育机能明显受损及其它中毒症状，甚至死亡。母体毒性作用与致畸作用关系外源化学物的母体毒性作用与致畸作用的关系有下列几个：1、含有致畸作用，但无母体毒性出现。表明此种外源化学物的致畸作用品有特定的作用机理，与母体毒性无关。此种受试物致畸作用往往较强，应特别注意。2、出现致畸作用的同时也体现母体毒性。此种受试物可能既对胚胎有特定的致畸机理，同时也对母体含有损害作用，但两者并无直接联系。3、不含有特定致畸作用机理，但可破坏母体正常生理稳态，以致对胚胎含有非特异性的影响，并造成畸形。4、仅含有母体毒性，但不含有致畸作用。5、在一定剂量下，既不呈现母体毒性，也未见致畸作用。此种状况较为复杂，实际有两种可能:一种是受试物确实不含有致畸作用，并且也不含有母体毒性；另一种状况是动物接触的剂量未达成致畸作用的最小有作用剂量，即致畸阈剂量，并非真正不含有致畸作用。在对一种外源化学物进行致畸实验时，如未观察到致畸作用，也无母体毒性体现，应在动物可能耐受条件下，最大程度地增加剂量，使其远远高于人类实际可能接触的水平，如仍未出现致畸作用，才可做出结论。严格的概念，在一定剂量下，能引发母体毒性作用，但未观察到致畸作用，才能够认为不含有致畸作用。母体毒性致畸作用较母体毒性作用剂量为低。四、发育毒性的剂量-反映模式和阈值的概念1、剂量效应关系复杂的体现及因素是：（1）机体在器官形成期间，与含有发育毒性的化合物接触，能够出现畸形，但也可引发胚胎致死。当剂量增加时，毒性作用增强，但两者增强程度并不一定成比例，往往胚胎致死作用增强更较明显，而致畸作用并不如此。由于胚胎死亡增加，畸胎数将因而减少。（2）某种致畸物能够引发一定的畸形，但在同一条件下，予以更高的剂量，并不出现同一类型畸形。可能由于较高剂量往往造成较为严重的畸形，较低剂量普通引发的轻度畸形，而严重畸形有时可将轻度畸形掩盖。例如一种致畸物在低剂量时，能够诱发多趾，中档剂量时则诱发肢长骨缩短，高剂量时可造成缺肢或无肢。（3）许多致畸物除含有致畸作用外，尚有可能同时出现胚胎死亡和生长缓慢；并且不同体现还能够互相影响，又无一定规律。因此剂量效应关系更为复杂。2、致畸作用的剂量反映曲线较为陡峭最大无作用剂量与100%致畸剂量之间距离较小，普通相差1倍，曲线斜率也较大，亦即致畸带较为狭小。往往100%致畸剂量即可出现胚胎死亡，剂量再增加，即引发母体死亡。尚有人观察到致畸作用最大无作用剂量与引发100%胚胎死亡的最低剂量仅相差2～3倍。例如剂量为5～10mg/kg体重的环磷酰胺予以受孕小鼠不体现致畸作用，但增加到40mg／kg体重，可引发100%胚胎死亡。致畸物剂量与反映关系阐明在致畸实验中，剂量的选择含有重要意义。因致畸实验重要观察指标为活产胎仔出生时存在的畸形，因此如果胚胎或胎仔大量死亡，则影响对致畸作用的观察，即使受试物有致畸作用，亦将被掩盖，无法被观察到。3、致畸作用最大无作用剂量问题尚有不同意见：普通认为机体接触低于致畸阈剂量的致畸物时，先天畸形、胚胎致死和生长缓慢发生率的自然本底质并不增高，表明这一剂量即为最大无作用剂量。但也有人认为致畸作用中的最大无作用剂量问题并无解决，重要是现在对于低剂量致畸物的作用与畸形自然发生率的本底值，尚不能明确分辨。掌握致畸作用中剂量与效应关系的规律，对外源化学物致畸实验中适宜剂量的拟定，含有重要意义。过低剂量局限性以显示确实存在的致畸作用，可得出错误的结论；剂量过高可使大量胚胎死亡或对母体毒性作用过强，都可影响成果的对的性。另外，评定一种致畸物对人体危害时，应充足考虑人体可能实际接触的剂量。在致畸实验中，对此将进一步讨论。致畸（发育毒性）作用机制发育的特点是在大小、生物化学和生理学、形态和功效方面的变化。这些变化受到管理基因转录的因素调节，这些因素在胚胎的基因组中使调节基因活动，并且持续的基因激话作用次第持续贯穿发育。现在，细胞间和细胞内对正常发育所必要的信号传导途径已被阐明，已知它们依赖于转录、翻译，以及翻译后(如，磷酸化作用)的调控。化学毒物对发育损伤的机制十分复杂，多数还不清晰。Wilsom(1977)提出了畸形发生的9种机制，涉及突变、染色体断裂、有丝分裂变化、变化核酸完整性或功效、减少前体或底物的补给、减少能源支持、变化膜特性、渗入压不平衡和酶克制作用。近年来在分子水平的研究有很大的进展，即使胚胎有代偿机制弥补外源性化学物的影响，但是，与否产生畸形依赖于在致病过程中的每个环节在损伤和修复之间的平衡。1、干扰基因体现某些基因的体现受到克制或异常体现可能引发畸形。如有报道在培养的小鼠胚胎中用反义寡核苷酸探针克制原癌基因Wnt-1或Wnt-3a，都可产生中脑和后脑，或中脑、后脑和脊髓的畸形。剔除Wnt—1基因的突变小鼠也可产生中脑和后脑的畸形。反之，如向小鼠胚胎中加人鸡的β－肌动蛋白启动子时，Hox-1.1基因体现，并产生多个颅脸部和颈椎的畸形。2、基因突变与染色体畸变已发现诱变原有潜在致畸性，如电离辐射、烷化剂、亚硝酸盐、多数致癌物都可能致畸。实验证明，妊娠第13天的大鼠胚胎羊膜内注入CP及其两个代谢活化的致畸性产物PM或AC后，CP和AC引发了脑积水、露眼、腭裂、小颌畸形、脐疝、尾部和肢部缺点；而PM仅仅引发脑积水，尾部和肢部缺点。3H标记CP的实验显示大概87％的放射性与蛋白质结合，5％与DNA结合，8％与RNA结合。使用碱洗脱，证明CP和PM引发单链DNA断裂，以及DNA-DNA和DNA-蛋白质交联。进一步的实验证明：PM的一种单功效烷化衍生物，有能力产生单链断裂但无DNA交联作用，引发了和PM同样的效应谱；而PM的一种非烷化衍生物(CP类似物)和AC不引发DNA损伤。AC易与蛋白质结合，而PM易与DNA结合。PM和AC对培养中的肢芽有明显的不同效应。这些成果提示PM和AC在胚胎中有不同的靶，PM对CP诱导的DNA损伤有责任，而AC可能通过与蛋白质结合而致畸。有报道染色体畸变占人类发育缺点因素的3％左右。这数字可能比实际低得多，由于常染色体数目的过多或缺少经常使胚胎死亡，难以发现或未作检查。而生殖丢失占很大比例。现在，大量的研究已证明，自发流产的胚胎中最少50％存在染色体畸变(重要是不分离)。电离辐射，病毒以及能引发染色体畸变的某些化学毒物都有致畸作用。3、损伤细胞和分子水平的翻译细胞增殖对发育显然是必要的。细胞增殖率在个体发生过程中空间和时间都在变化，在胚胎中细胞增殖、分化和凋亡之间有精巧的平衡。用CP解决妊娠第10天大鼠，引发胚胎的S-期细胞周期阻断，在细胞快速增殖区域观察到细胞死亡。细胞周期长度的不同可能部分地影响敏感性。如：胚胎的神经上皮对CP诱导的细胞死亡相称敏感，而心脏有抵抗力。第10天大鼠胚胎神经上皮的细胞周期时间大概为9.5h，而在心脏中的细胞周期大概是13.4h，这是由于心脏细胞比神经上皮有更长的Go／Gl期。对DNA的损伤可在G1-s转换时、S期和G2-M转换时克制细胞周期的进展。CP诱导DNA损伤可造成细胞周期混乱和特定的细胞群体中的细胞死亡。如果DHA损伤被修复，细胞周期能恢复正常，但如果损伤太广泛，或细胞周期克制太久，可能引发凋亡。在全胚胎培养中使用活化的CP也观察到相似的胚胎细胞周期阻断和细胞死亡。4、细胞调亡细胞凋亡，又叫程序性细胞死亡，指胚胎中在遗传基因的控制之下的特定类型的细胞死亡。凋亡对来自原基的构造的造型是必需的。有不少致畸物，如细胞生长依赖激素、乙醇、抗癌药品都能增进细胞凋亡。在凋亡中起一定作用的基因在不停增加。p53基因，有肿瘤克制基因的作用，能增进凋亡或生长停止。在正常的发育期间出现的凋亡不需要p53基因，例如，有p53-缺点的胚胎能正常发育。然而，p53可能在对DNA损伤的反映中对造成生长停止或凋亡有重要作用。如，与正常纯合子(十／十)的对摄影比较，在杂合子p53缺点(P／十)妊娠小鼠的子代中，苯并[a]芘引发的胎儿吸取和产后死亡的发病率分别增加了3倍和10倍以上。生长因子和某些细胞因子(IL-3，IL-6)能防止p53-依赖的凋亡。c-myc产物的体现使DNA持续不停地合成，而面临DNA损伤时它可能促成凋亡。Bcl-2有作为凋亡的阻遏物的功效和与类似物Bax结合的功效，Bax可与它自己或与Bcl-2成为二聚物。Bax同型二聚体促成细胞死亡，Bcl-2／Bax异型二聚体克制细胞死亡。已证明，致畸因子过高热、环磷酰胺或砷酸盐解决着床后的小鼠胚胎，在某些胚芽组织中与凋亡一起造成DNA断裂、caspase-3的话化和多聚(腺甘酸二磷酸-核糖)聚合酶(PABP)的分裂。这些因子还能引发胚胎线粒体的变化而造成细胞色素C的释放，并造成caspase-3上游的活化因子caspase-9的活化。5、干扰细胞细胞交互作用反映停的代谢活化产物引发胚胎细胞的粘连受体(adhesivereceptors)下调，妨碍发育过程中细胞与细胞和细胞与基质之间的互相作用，干扰了细胞之间的通讯从而造成肢芽构造异常。6、通过胎盘毒性引发发育毒性已知对卵黄囊或绒(毛)膜尿囊胎盘有毒性的毒物有46个，涉及镉(Cd)、砷或汞、香烟、乙醇、可卡因、内毒素和水杨酸钠等。如Cd在妊娠中晚期通过引发胎盘毒性(坏死，减少血流)和克制对营养物质的传送造成发育毒性。实验发现，在妊娠晚期大鼠体内注入Cd造成胎儿死亡，但几乎没有的进入胎儿体内，而是在10h内随着子宫胎盘血流减少发生胎儿死亡；如胎儿直接注射Cd，尽管胎儿的Cd负荷比母体给药后高几乎10倍，胎儿死亡仅只有轻微增加。另外，Cd可在胎盘诱导金属结合蛋白(或称金属硫蛋白，MT)，而MT对Zn有高亲和力，可在胎盘中结合Zn而干扰Zn转移通过胎盘。Cd的理化性质与必需元素锌(Zn)相似，可竞争性克制人类通过胎盘微泡吸取Zn跨膜转运，以及竞争性地在胎盘中克制其它的Zn依赖的过程。联合予以Zn能够改善Cd的发育毒性。7、干扰母体稳态二氟苯水杨酸，引发兔的中轴骨骼缺点。其发育毒性剂量引发严重的母体贫血并损耗红细胞ATP水平。妊娠第5天给单剂量的二氟苯水杨酸引发持续到第15天的母体贫血，而这正是缺氧引发类似的中轴骨伤缺点的核心日子，胚胎中血药浓度低于母体的血药峰水平的5％。因此，二氟苯水杨酸对兔的致畸性或许是由于母体的贫血造成缺氧的成果。苯妥英在实验动物中能影响母体的叶酸代谢致畸。孕第10天，易感的A／J小鼠的心率剂量依赖性地被苯妥英减少，实验性给氧可减少小鼠中苯妥英的致畸性；而抗性的C57B1／6J小鼠心率不减少。因而认为，畸形与母体的心率减少和胚胎的缺氧有关。减少子官的血流被认为是经基脲引发致畸的一种机制，它提高收缩压，变化心率，减少心输出，严重地减少子宫的血流，并且在妊娠兔中增加血管的阻力，给药后胚胎立刻显示颅面和心包出血。而通过夹紧妊娠兔子宫血管10min可引发同样的胚胎异常。MT合成可被涉及金属、酒精、胺基甲酸乙酸、内毒素、烷化剂、高或低血糖和电离辐射等许多化学和物理因素诱导，也可被糖皮质激素和某些细胞因子等内源性调节剂诱导。MT合成的诱导可造成孕母肝MT浓度大大高于正常，减少血浆Zn浓度，进而使孕体可运用的Zn减少、Zn缺少而造成发育毒性。这已为多个不同的化学物涉及丙戊酸、6-巯基嘌呤、乌拉坦、乙醇和常春藤皂贰的实验所证明。孕妇缺少代谢前体或基质也是致畸机制之一。膳食中某些营养素缺少，特别是维生素和无机盐类缺少易造成生长缓慢、致畸或胚胎死亡。我国因孕期母体缺碘或新生儿期缺碘，造成的智力低下小朋友近1000万。因此政府推广食用加碘盐。8、内分泌干扰作用激素含有对内环境稳定的维护和发育过程的调节作用。内分泌干扰物为干扰激素的制造、释放、传送、代谢、结合、作用或排除的外源性因子。涉及杀虫剂、除草剂、杀菌剂、塑化剂、表面活化剂、有机金属、卤代杂环烃、植物雌激素等。由于激素在许多组织中有指导分化的核心作用，发育中的生物体对有激素或抗激素活性的化学物特别敏感。内分泌干扰物最少通过四种干扰内分泌系统的作用模式引发发育毒性：①作为类固醇受体的配体起作用；②变化类固醇激素代谢酶；③扰乱下丘脑。垂体激素释放；④通过现在还不清晰的模式作用。典型的例子是己烯雌酚(DES)，在小鼠中造成涉及雄性和雌性生殖道和脑畸形的发育毒性。雌性子代出现不育，输卵管、子宫、子宫颈和阴道的构造异常和卵泡的损耗和畸形3雄性子代可体现出尿道下裂，精子形态学和运动性异常，生殖道损害(涉及隐睾症和睾丸癌)，不育等。在发育期暴露抗雄激素物质重要显示男性异常，涉及尿道下裂，保存乳头，睾丸和副性腺重减少，精子产生减少。发育毒性和致畸作用实验与评价致畸作用是发育毒性中最重要的一种体现，因另外源化学物发育毒性的评定，重要是通过致畸实验。在致畸实验中除可观察到出生幼仔畸形外，也可同时发现生长发育缓慢和胚胎致死。传统常规致畸实验是评定外源化学物与否含有致畸作用的原则办法，数年来诸多国家和机构都采用和推荐这一办法。一、动物发育毒性实验1、动物选择致畸实验的动物选择，除参考毒性实验中选择动物的普通原则，即食性和对受试物代谢过程与人类靠近，体型小，驯服，容易喂养和繁殖及价廉外，还应特别注意妊娠过程较短、每窝产仔数较多和胎盘构造及厚度与人类靠近等特点。根据上述原则综合考虑，致畸实验可选用二种哺乳动物，普通首先考虑大鼠，另外可采用小鼠或家免。大鼠受孕率高，每窝产仔8～10只，易于得到足够标本数；并且经验证明，大鼠对大多数外源化学物代谢过程，基本与人类近似，故可首先考虑。但大鼠对普通外源化学物代谢速度，往往高于小鼠和家兔，以致对化学致畸物耐受性强、易感性低，有时出现假阴性。大鼠在器官发生期早期，其胎盘含有卵黄囊，称为卵黄囊胎盘，在器官发生期后期，将转变为绒膜尿囊胎盘，有些外源化学物，例如锥虫蓝能够干扰通过卵黄囊胎盘对胚胎的正常营养过程，并因此致畸，出现阳性成果；而人类胎盘不含有卵黄囊胎盘阶段，不存在同样问题，因此有时此种成果对人类为假阳性。小鼠自然畸形发生率较大鼠高，但低于家兔，对形成腭裂的致畸物更较敏感。家兔为草食动物，与人类代谢功效差别较大，妊娠期不够恒定，有时延长至36天，自然畸形发生率也较高。2、剂量分组由于致畸作用的剂量效应（反映）关系曲线较为陡峭，斜率较大，最大无作用剂量与引发胚胎大量死亡以及母体中毒死亡的剂量极为靠近。因此在拟定剂量时，首先规定找出最大无作用剂量以及致畸阈剂量；同时还要保持母体生育能力，不致大批流产和过多胚胎死亡；较多母体死亡也应避免。普通应先进行预试，预试的目的是找出引发母体中毒的剂量。根据预试成果能够拟定正式实验剂量。应最少设3个剂量组，另设对照组。原则上最高剂量组，能够引发母体轻度中毒，即进食量减少、体重减轻、死亡不超出10%。最低剂量组不应观察到任何中毒症状；中间剂量组能够允许母体出现某些极轻微中毒症状。其剂量与高剂量和低剂量成等比级数关系。普通最高剂量不超出LD50的1/5～1/3，低剂量可为1／100～1／30。这一原则在预试中也可试用。如已掌握或能预计人体实际接触量，也可将实际接触量作为低剂量，并以其10倍左右为最高剂量。凡急性毒性较强的受试物，所采用剂量应稍低，反之可较高。也有人以亚慢性毒性实验的最大无作用剂量为高剂量，并以其1／30为低剂量，可供参考。每组动物大鼠或小鼠为12～20只，家兔8～12只，狗等大动物3～4只。在普通常规实验中，除设有3个剂量组和一种对照组外，如受试物溶于某种溶剂或介质中予以动物，则另设溶剂对照组。有时为了更加好地验证明验成果。另设阳性对照组，按大鼠每kg体重15000IU维生素A剂量，或将每ml含50000IU维生素A的浓鱼肝油，按每100g体重1ml剂量给大鼠灌胃。另外敌枯双、五氯酚钠等也可采用。致畸实验的剂量分组，可因实验目的的不同而异，如实验的重要目的是先拟定受试物有无致畸作用，则组数可先对减少，但每组动物数应较多。如观察剂量－效应关系，则组数应增加。3、动物交配解决将性成熟雌雄动物按雌雄l：1或2：1比例同笼交配。每日将已拟定受孕雌鼠随机分入各剂量组和对照组。拟定受孕办法是阴栓检查或阴道涂片精子检查。出现阴栓或精子之日即为受孕0日，也有人作为第1日。精确拟定受孕日对精确掌握动物接触受试物时间、最后处死动物及拟定进行检查的日期非常重要。由于致畸作用有极为明确的敏感期，应精确掌握动物接触受试物的时间，必须在器官发生期。如提前在着床前接触，将影响受精卵的着床。如在胚胎发育的最初阶段，例如裂卵期和囊胚期接触受试物，往往可使胚胎死亡，不能造成畸形。如在器官发生期后来接触受试物，则多个器官已发育成熟，致畸作用不易体现。只有器官发生期的胚胎，对致畸物最为敏感，易于出现畸形。大鼠和小鼠普通可自受孕后第5天开始予以受试物，每日一次，持续到第15天。如拟进一步研究何种器官对受试物更为易感，则应在上述期间将受试物每日分别予以一批动物，每批动物只接触受试物一次，最后能够根据畸形出现的状况，拟定受试物的重要靶器官。接触受试物的方式与途径应与人体实际接触状况一致，普通多经口予以。也可采用灌胃方式，以确保剂量精确，效果较混入饲料喂给为好。在特殊状况下，也可采用腹腔注射法，效果与经口近似。实验期间每2～3天称取母鼠体重。首先可根据体重增加，随时调节予以受试物的剂量，同时也可观察受孕动物的妊娠状况和胚胎发育状况。受孕动物的体重如持续增加，则表达妊娠过程及胚胎发育正常；如体重停止增加或下降，可能由于受试物的毒性作用或母体的其它因素，引发胚胎死亡或流产。4、胎仔检查自然分娩前1～2日将受孕动物处死，剖腹取出子宫及活产胎仔，并另行统计死胎及吸取胎。普通大鼠在受孕后第19～20天，小鼠第18～19天，家兔在第29天。活产胎仔取出后，先检查性别，逐只称重，并按窝计算平均体重，然后由下列几方面进行畸形检查：①外观畸形肉眼检查，例如露脑；②肉眼检查内脏及软组织畸形，例如腭裂；③骨骼畸形检查，例如颅顶骨缺损，分叉肋等。畸形检查只限活产胎仔。以上检查只能检出构造与形态异常的畸形，不能检出可能发生的生化功效或神经行为缺点。因此有人主张将实验雌鼠保存1/4左右，待其自然分娩，并将出生幼仔喂养观察，最少到断奶，方便检查可能存在的先天缺点和生理功效异常。二、流行病学研究和人类的证据在致畸实验成果评定时，重要计算畸胎总数和畸形总数。计算畸胎总数时，每一活产幼仔出现一种或一种以上畸形均作为一种畸胎。计算畸形总数时，在同一幼仔每出现一种畸形，即作为一种畸形；如出现二种或二个畸形，则作为二个畸形计，并依这类推。计算时还要对剂量效应（反映）关系加以分析。更重要的是按下列指标将各剂量组与对照构成果进行比较。活产幼仔平均畸形出现数：即根据出现的畸形总数，计算每个活产幼仔出现的畸形平均数。对较为重要的畸形，还可分别单独进行计数。畸形出现率：即作为畸胎的幼仔在活产幼仔总数中所占的百分率。母体畸胎出现率：即出现畸形胎仔的母体在妊娠母体总数中所占的百分率。计算出现畸形母体数时，同一母体无论出现多少畸形胎仔或多少种畸形，一律按一种出现畸胎的母体计算。在评定实验成果和进行实验组与对照组对比时，应当按每个母体为单位，即按每窝计算。在致畸实验中，每个母体或每窝是实验单位。根据上述指标，进行初步计算后，拟定受试物与否含有致畸作用的最后结论时，尚需注意下列几点：（１）任何成果必须通过统计计算办法进行剂量组与对照组对比；必须含有统计学意义才干认为是阳性成果。另外，还应充足注意到剂量－效应关系与否较为明显，较为明确者才可拟定其致畸作用。（2）应当掌握所用实验动物品系的自然畸形发生率。如出现长久以来在该品系实验动物未曾出现过的畸形，则应特别认真看待。但即是实验动物出现的重要畸形类型在该品系实验动物中过去也常出现，也不能认为此项成果不含有阳性成果的意义，容易作出不含有致畸作用的结论。（3）致畸作用中动物物种和品系差别较为显着，因此规定在两种动物进行实验。如果在一种动物观察到致畸作用，二另一种未观察到，从毒理学安全角度，能够认为该受试物仍含有潜在致畸可能性，尚需认真看待。尽量较少人类与其接触的机会。即使两种动物都未观察到致畸作用，也应对实验办法和实验过程进行认真检查，必须绝对可靠，才干作出不含有致畸作用的结论，对此应格外谨慎。（4）由于物种差别，对动物不含有致畸作用的外源化学物对人与否致畸的问题。即将动物实验结论推论到人，尚无抱负可靠的办法。亦应格外认真看待。凡代谢状况及毒物动力学参数相近者，将动物实验成果推论到人，较为可靠。另外，还可运用流行病调查办法，进行人群调查，掌握在人群致畸作用的实际状况。在这种状况下，应特别注意人体的实际可能接触的剂量。经验表明，甚至人体需要的营养素达成一定的剂量，也呈现致畸作用，如维生素A。故考虑任何外源化学物对人体致畸作用时，必须充足考虑人体实际可能接触量与动物实验中的最小有作用剂量（即致畸阈剂量）之间的剂量距离范畴。致畸物以及发育毒性作用物危险度评定（1）、欧共体（EEC）和经济合作与发展组织（OECD）建议的致畸物分级原则。重要根据动物实验和人群调查资料，具体分级原则：1级、已拟定人类母体接触后可引发子代先天性缺点；2A级、对动物必定致畸，但对人类致畸作用尚未拟定因果关系；2B级、动物实验成果必定致畸，但无人类致畸资料；3级、尚无结论性必定致畸证据或资料局限性；4级、动物实验阴性，人群中调查成果未发现致畸（2）、致畸指数：母体LD50与胎仔最小致畸作用剂量之比，即母体LD50／胎仔最小致畸作用剂量。这一比值愈大，致畸作用愈强，普通认为比值10下列者，不具致畸作用，10～100具致畸作用，100以上致畸作用强烈。（3）、相对致畸指数（RTI）：成年动物最小致死剂量（LD01）与引发5%活产胎仔出现畸形的剂量（tD05）之比值，即LD01／tD05。（4）、母体毒性与发育毒性比值：或称成年毒性与发育毒性比值，即对母体最低损害作用剂量（A）与胎仔最低损害作用剂景（D）之比（A／D）。普通认为A／D比值为3或3以上者，则含有发育毒性危险性。比值越大，危险性越高，3下列者，相对危险性较低或不具危险性。在普通状况下，大多数化合物A／D比值均在3下列，以及1～2范畴内。有关母体和胎仔最低损害作用的具体体现，在母体重要为体重增加减少，出现某些临床症状以及死亡，对胎仔则为致畸以及其它发育毒性体现。三、发育毒性的替代实验用动物实验来检测、研究化学毒物的发育毒性既费钱又费时间。数年来许多研究者始终在谋求简朴、快速的体内、外实验办法，用来评价化学毒物的发育毒性和(或)探讨其作用机制，迄今还没有满意的办法，由于发育毒性涉及亲代两性，从配子到下一代出生的多个发育阶段，不能只用一、二种办法去回答这样复杂的毒性问题。这些替代实验的验证仍然是重要的和迄今无法解决的问题，缺少公认的原则，来自实验的敏感性的意义和对成果的特异性的评价都有疑问。已知的胚胎形成的复杂性和潜在的发育毒性机制