毛果杨nlp基因家族的生物信息学分析

毛果杨nlp基因家族的生物信息学分析

植物需要在整个生命周期中产生大量的氮素营养。硝酸盐是土壤中存在的一种主要氮素形态,在植物生长以及发育过程中发挥重要的生理以及营养作用［1］。植物中一些氮素吸收以及同化相关基因能够受外界氮素浓度的影响在表达上发生变化,如铵转运蛋白基因(AMT),硝酸盐转运蛋白基因(NRT),硝酸还原酶基因(NR)以及亚硝酸还原酶(NIR)［2～5］等。一些具有感知硝酸盐信号能力的基因与转录因子在硝酸盐吸收以及同化的过程中起着重要的调控作用［6］。NIN(noduleinception)基因在百脉根中被首次发现,并确豆科植物根瘤形成依赖于该基因的存在,后续的研究发现,在非豆科植物中也存在该类基因,推断其可能参与到硝酸盐的同化过程之中,并命名为NLP(NINlikeprotein)基因［8～9］。NLP基因家族成员都具有RWP-RK和PB1两个典型的结构域,RWP-RK结构域具有与DNA结合的功能,PB1结构域具有与其他含有该结构域的基因形成二聚体的功能［8］。2008年在拟南芥中发现NLP7是具有感应硝酸盐信号的转录因子,在拟南芥中敲除NLP7后,拟南芥突变体nlp7与正常野生型相比显示出明显的缺氮状态与抗旱能力,并且NRT2;1/2;2与NIR1/2基因表达量均显著性下调;当在nlp7突变体中恢复NLP7表达之后,不仅恢复了这些基因的表达而且还恢复了突变体对硝酸盐的吸收,由此证明NLP7基因具有参与感受硝酸盐信号以及调节硝酸盐吸收的功能［7］。2013年陆续两篇文章对NLP基因家族成员的作用机理进行了系统的报道。Konishi等证明NLP基因的蛋白质N端能够感受硝酸盐信号,而后特异性的结合启动子中具有NRE(nitrate-responsivecis-element)原件的基因,从而调节植物对硝酸盐的吸收以及同化［11］。Marchive等对NLP7基因能影响的所有的代谢通路以及在硝酸盐早期吸收以及利用上进行了细致的研究,结果表明NLP7基因不仅参与调控N代谢循环,还对C代谢循环以及激素代谢有一定的调控功能［10］。杨属(Populus)植物具有易繁殖,生长迅速等特点,并且诸多树种已经建立了完善的遗传转化体系,成为木本植物研究的模式生物。自2006年毛果杨(Populustrichocarpa)基因组数据公布以来,其功能基因组学研究已逐步深入,仅就氮素吸收方面,毛果杨的AMT基因家族与NRT基因家族已经被详细的分析［12～13］。本研究,以生物信息学方式对毛果杨的NLP基因家族成员进行确定,直系同源与旁系同源进化分析,基因结构分析,保守结构域分析,以及全组织表达模式分析,为进一步研究杨树NLP基因功能以及在对硝酸盐吸收与同化过程中的调控模式提供基础。1材料和方法1.1nlp基因家族成员的确定［14～15］。将候选基因分别在SMART(SimpleModularArchitectureResearchTool)(http://smart.embl-heidelberg.de/)数据库分析验证RWP-RK与PB1基序的存在,将具有RWP-RK与PB1结构域的基因后确定为杨树NLP基因家族成员。1.2杨树nlp基因家族成员的蛋白质序列理化性质分析与细胞定位预测1.3旁系同源进化树的构建［16］。将毛果杨NLP基因家族成员蛋白质序列通过ClustalW2软件进行多重序列比对,利用软件MEGA5采用邻近法(N-J)法构建旁系同源进化树,bootstrap值设置成1000次。1.4铬定位分析［17］。1.5基因结构分析1.6杨洁篪遗传因子的表现模式分析［18～19］。2结果与分析2.1rwp-rk的低亲水性基因家族pb1经分析,最终确定了14个毛果杨NLP基因家族成员(表1)。这些毛果杨NLP基因家族成员均含有RWP-RK与PB1保守结构域。他们的蛋白质长度不等,最短的为519aa,最长的为1000aa。整个基因家族都具有低亲水性的特点,GARVY值从-0.38~-0.646不等。等电点(pI)值最高达到7.86,最低的为5.25。所有家族成员均为细胞核定位。2.2毛果杨nlp基因家族成员构成为确定毛果杨NLP基因家族的本质特征,我们分别进行了直系同源以及旁系同源的进化分析。通过直系同源分析发现,NLP基因家族共分成3个明显的亚枝,分别将各亚枝命名为NLP1cluster,NLP2cluster和NLP3cluster(图1)。在毛果杨中,NLP3cluster的成员最多,达19个,而NLP1cluster和NLP2cluster分别有3个和2个成员。与拟南芥相比毛果杨NLP基因家族成员的总数量是拟南芥的1.56倍,这个满足Tuskan等提出的毛果杨基因家族成员的个数是拟南芥的相应同源基因数的1.4~1.6倍的推断［17］。通过旁系同源进化分析我们共在毛果杨中找到6对同源基因对,每一个基因同源对的基因相互间同源性极高,这说明毛果杨NLP基因家族成员在杨树进化过程中经历了严格的进化选择(图2A)。2.3毛果杨基因组中的染色体同源基因为了明确毛果杨NLP基因家族成员间的进化关系,我们对所有成员进行了染色体定位分析。在14个成员中只有PtrNLP13不能定位在染色体上而是定位在scaffold片段外,其余的基因都分别定位在1、2、3、4、5、7、9、16和17号染色体中的染色体同源区域之内(图3)。杨树基因组在进化史上经历了两次染色体扩增事件,第一次来自拟南芥染色体加倍,第二次来自杨柳科染色体加倍［17］。在毛果杨基因组中存在着大量的染色体同源区域,在可以定位在毛果杨染色体中的NLP基因家族成员中除PtrNLP9丢失了同源基因外,其余的基因都能在相应的染色体同源区域中找到相应的同源基因。基因家族成员的扩增来源于基因组的同源交换,染色体串联复制等其他基因组进化的大事件。在毛果杨NLP基因家族成员的扩增中,主要是由于染色体的同源复制引起的。我们的分析发现4对基因(PtrNLP1/2,PtrNLP8/9,PtrNLP10/11和PtrNLP12/14)是由染色体片段复制事件引起的。而PtrNLP3/4/6/7四个基因有可能来源于同一个祖先基因,在毛果杨染色体进化史经历了染色体片段复制后,又经历了两次串联复制。该结果表明,毛果杨NLP基因家族成员的扩增来源于染色体的片段复制以及串联复制事件。2.4nlp3clnuser成员间的基因结构为了进一步的了解毛果杨NLP基因家族成员间的特征,我们分析了毛果杨NLP基因家族成员的基因结构(图2B)。NLP1/2cluster成员均含有5个外显子,并且基因结构比较保守。但NLP3cluster成员含有2~7个外显子,并且成员间基因结构有所差异。通过外显子比对分析发现这种差异是由于外显子的丢失以及内含子的插入或者缺失造成的。多重比对分析结果显示,杨树NLP成员间蛋白质序列比较保守,均含有RWP-RK与PB1保守区域,另外还存在4个未知功能的保守基序。但PtrNLP1C端大面积缺失,不存在这四个未知功能的保守基序(图4)。2.5表达模式分析3毛果杨nlp基因家族分析NLP基因家族成员是一类转录因子,广泛存在于豆科植物以及非豆科植物当中,它主要参与豆科植物根瘤的形成以及调控植物根部硝酸盐的吸收［9］。拟南芥NLP基因家族成员的RWP-PK结构域的N端侧翼序列具有感受硝酸盐信号的功能,在感受到硝酸盐信号后,NLP7蛋白质脱离翻译后修饰状态进入活跃状态,特异性的识别并结合具有NRE原件的基因的启动子上,从而对提高可受硝酸盐诱导的基因进行调控［10～11］。目前为止,植物中的NLP基因功能性研究较少,只有拟南芥NLP基因家族成员有较为详细的功能性研究,而全基因组鉴定方面的报道更是少之又少。本文以毛果杨为模式植物,首次对林木类植物的NLP基因家族进行分析。通过对最新毛果杨蛋白质数据库的搜索,我们共发现14个毛果杨NLP基因家族成员。毛果杨NLP基因家族成员的基因结构和结构域分布非常保守,都含有RWP-PK与PB1结构域,与其他非豆科植物NLP基因一样,毛果杨NLP基因在N端多出两段保守序列,这为豆科植物NLP基因与非豆科植物NLP基因功能上的差异性提供了分子证据［8］。直系同源进化分析结果表明,PtrNLP10/11与拟南芥AtNLP6/7被分配在同一个亚枝之中,并且PtrNLP11与AtNLP7具有相似的表达模式,因此我们推测PtrNLP11与AtNLP6/7具有相似的功能在杨树根的硝酸盐吸收以及同化过程中发挥重要的作用。芯片表达模式结果显示