连钱草愈伤组织培养的研究

连钱草愈伤组织培养的研究

连金草是著名的血毒症、金钱草和佛耳草科。这是嘴唇科的一种活血药物。它具有清热解毒、利尿、祛石、驱瘀消肿的功效。它用于治疗尿结石、肝结石、湿热黄疸、跌倒和碰撞损伤等症状。已被《中华人民共和国药典》收录。连钱草茎、叶含挥发油，其有效成分为松樟酮、薄荷酮、异薄荷酮、番薄荷酮等，尚含熊果酸、琥珀酸多种化学成分，但天然植物体内化学成分的含量较低，要提取其化学成分就要大量开采连钱草植株，这对生态平衡有一定破坏作用。随着生物技术的发展，通过植物组织培养方法，可以生产天然的植物成分并提高某些植物成分的含量，如通过对红豆杉(Taxuschinensis(Pilg．)Rehd．)愈伤组织培养，使紫杉醇及三尖杉醇的含量均高于外值体中的含量。目前，对于唇形科药用植物的愈伤组织培养已有一些报道，但有关连钱草愈伤组织培养国内外尚未见公开报道。本研究基于上述研究现状，对连钱草愈伤组织诱导进行初步探索，获得连钱草愈伤组织诱导及增殖的适宜培养条件，为建立大规模细胞培养生产连钱草有效药用成分提供了必要前提条件。1材料和方法1.1材料表面愈伤组织培养所用的外植体来自于嘉陵江流域南充段野生连钱草。1.2组织损伤的诱导和培养1.2.1培养条件优化于2～6月陆续从母株上取8cm左右的顶芽、叶、叶柄，自来水冲洗表面杂物，洗洁净溶液浸泡10min，自来水冲洗20min，双蒸水清洗外植体后，放入培养皿内，酒精擦拭后放入超净工作台。70%乙醇，浸泡消毒30s，双蒸水清洗4次。次氯酸钠浸泡1～15min(视材料的幼嫩程度而定)，放入培养皿中双蒸水清洗数次。剪取顶芽(0.5～1cm)、叶片(0.5cm×0.5cm)、叶柄(0.5cm)、接种到培养基上。1.2.2细胞分裂素ba、kt和4-d的体外培养选用基本培养基MS和LS，改良后分别添加不同类型和浓度的生长素2,4-D、NAA和细胞分裂素BA、KT,30g·L-1蔗糖，8g·L-1琼脂，0.1mol·L-1NaOH和0.1mol·L-1HCl调节pH为5.8，高压(121℃)灭菌15min。1.2.3诱导过程光照条件置于HPG-280H人工气候箱内培养，温度为(24±2)℃。诱导过程光照条件分两种处理:24h暗启动培养后光、暗交替培养(14h光照，10h黑暗)，光照强度2000lx;全程黑暗培养。1.3人工气候箱在诱导过程中，如发现外植体染菌，则马上将此瓶取出人工气候箱。培养30d后，将未染菌外植体计算诱导率，计算公式如下:出愈率(%)=(出愈外植体快数×100)÷(接种数-染菌快数)1.4增殖率的测定先称量继代接种前培养瓶的重量，再称接种后的重量，从而得到接种的愈伤组织重量。培养14d后，再次进行接种，按同上方法测知14d后愈伤组织的重量，通过以下公式求增殖率:接种鲜重(mg/瓶)=接种后瓶重(mg)-接种前瓶重(mg)收获鲜重(mg/瓶)=收获前瓶重(mg)-收获后瓶重(mg)增殖率(%)=收获鲜重÷接种鲜重×100%2结果与分析2.1外植体来源消毒效果以野外生长和室内盆栽生长一段时间后新生幼叶为外植体，用2%的NaClO溶液各消毒2min，试验外植体来源不同对消毒效果的影响(表1)。结果表明:在其它条件相同情况下，野生植株的污染较为严重，污染率达45%，而室内盆栽植株污染率仅为16.67%。表1列出了野外和室内栽种外植体来源分别对消毒效果的影响情况。2.2ms培养基不同培养条件对连钱草诱导率的影响基本培养基的类型是愈伤组织诱导的一个重要影响因素，本试验选用MS、LS培养基，分别添加2mg·L-1的2,4-D调整pH到5.8，经加热溶解后，分装至50mL三角瓶中，每瓶20mL,0.15MPa压强下消毒15min后冷却，在超菌工作台内接种后放置于光、暗交替培养和暗培养。30d后观察并计算连钱草在两种培养基下出愈率(表2)。通过试验得知，连钱草在MS培养基光、暗交替条件下诱导率最高(54.23%);在LS暗培养条件下次之(34.43%);在MS培养基暗培养条件下和在LS光、暗交替培养条件下都相对很低。因此，MS培养基在光、暗交替培养条件下对连钱草外植体愈伤组织诱导最为有利。2.3植物激素的筛选2.3.1不同浓度同生长素对连钱草愈伤组织诱导率的影响选择MS基本培养基配比以不同浓度的生长素2,4-D和NAA接种外植体于光、暗交替培养，以筛选出最优化的生长素及其对连钱草愈伤组织诱导的最适浓度(表3)。试验表明，不同生长素对连钱草愈伤组织诱导具有显著差异:2,4-D比NAA更适合于连钱草愈伤组织的诱导，在2,4-D与BA(1.0mg·L-1)组合的培养基上，连钱草愈伤组织诱导率整体都较高，并且在一定范围内随着2,4-D浓度的增加，愈伤组织诱导率随着增加，当浓度达到1.5mg·L-1时，诱导率达到一个最大值，当其浓度再增加时，则抑制愈伤组织诱导，因此，诱导率又呈现下降趋势。在NAA与BA(1.0mg·L-1)组合的培养基上，连钱草愈伤组织诱导率很低，说明NAA不适于连钱草外植体脱分化成愈伤组织。2.3.2,4-d1.5.4整体诱导大鼠愈伤组织诱导率植物愈伤组织诱导的优化通常需要生长素和细胞分裂素协调。因此，在MS光、暗交替培养，得出选取2,4-D(1.5mg·L-1)的最适生长素条件下，配比以两种不同浓度的细胞分裂素BA、KT进行优化试验(表4)。试验显示，BA和KT都能与2,4-D(1.5mg·L-1)组合诱导出连钱草愈伤组织。BA在0～1mg·L-1范围内，随着浓度增加，诱导率增大，当BA浓度大于1mg·L-1时，愈伤组织诱导率开始下降，说明高浓度(>1mg·L-1)BA抑制愈伤组织诱导;KT则在0.5mg·L-1时最为适宜，当大于0.5mg·L-1时，愈伤组织诱导即受到抑制，低浓度(<0.5mg·L-1)KT适宜于连钱草愈伤组织诱导。综合比较，连钱草愈伤组织诱导在MS+2,4-D(1.5mg·L-1)+BA(1mg·L-1)组合的培养基条件下诱导率最高。2.4钱草愈伤组织诱导以叶片、茎尖和叶柄为外植体，接种于MS+2,4-D(1.5mg·L-1)+BA(1.0mg·L-1)培养基上，试验连钱草愈伤组织诱导情况(表5)。结果显示:茎尖的愈伤组织诱导率非常低，不适宜于连钱草愈伤组织的诱导;叶和叶柄均可诱导形成愈伤组织，叶诱导率达91.38%，叶柄诱导率达100%;两种外植体诱导出的愈伤组织在生理形态上有一定的细微差异，叶诱导出的愈伤组织呈白色略黄，疏松。叶柄诱导出的愈伤组织呈黄色，紧密。并且通过对比得知，叶诱导出的愈伤组织增殖明显比叶柄快(图1)。2.5债权配比培养基上的增值率选择健康愈伤组织分成小块接种于新鲜培养基上进行继代培养。14d后，再次继代接种，记录数据，探讨愈伤组织在2,4-D和BA配比培养基上的增值率(表6)。结果表明，连钱草愈伤组织增殖率较低，在MS+2,4-D(1.5mg·L-1)+BA(1.0mg·L-1)培养基下，增殖率达到最大(202.2%)，当2,4-D浓度超过2.0mg·L-1时，愈伤组织呈灰黄色，并且极易褐化。3连钱草愈伤组织的诱导连钱草体表被柔毛，野生植株污染严重，多次接种都难获得无菌的材料，应采取严格的预防措施，先将野生植物样本掘出，剪除一些不必要的部分，改为室内盆栽，等它们长出新苗后，再行采样接种，可以大大增加无菌材料获得率。通过添加以生长素2,4-D的基本培养基试验连钱外植体诱导得知:MS在光暗交替条件下和LS在黑暗条件下均可诱导连钱草愈伤组织的形成。MS基本培养基在植物愈伤组织诱导培养中已被广泛的采用，同为唇形科药用植物的丹参(SalviamiltiorrhizaBge．)、紫苏(Perillafrutescens)、黄芩(ScutellariabaicalensisGeorg)皆有以MS基本培养基诱导愈伤组织形成的报道，本试验发现，MS培养基也是连钱草愈伤组织诱导生长的适宜培养基。而以LS培养基诱导培养愈伤组织的却较少，HirobumiYamamoto等以LS为基本培养基，成功诱导出小檗科植物淫羊藿(Epimediumdiphyllum)愈伤组织，本试验发现，在LS培养基上也能诱导出连钱草愈伤组织，但在后来的愈伤组织培养中发现LS培养基中的愈伤组织生长缓慢，因此，在LS培养基上，连钱草愈伤组织培养条件还需要进一步研究。通过在MS基本培养基光、暗交替培养条件下植物激素的筛选实验得知:植物激素是连钱草外植体脱分化为愈伤组织的重要影响因素。生长素2,4-D能促进连钱草外植体脱分化形成愈伤组织，而NAA则抑制愈伤组织的形成;细胞分裂素KT和BA均能促进连钱草愈伤组织的形成。其诱导最佳培养基是MS+2,4-D(1.5mg·L-1)+BA(1.0mg·L-1)，在此条件下以叶为外植体，诱导率可达91.38%;以叶柄为外植体，诱导率高达100%;但连钱草茎尖愈伤组织诱导率却很低，肖关丽等对甘蔗(Saccharumsinensis)不同叶位幼叶鞘内源激素与愈伤诱导率关系研究发现，甘蔗不同叶位幼叶鞘内源激素的差异与愈伤组织诱导率有关，连钱草茎尖愈伤组织诱导率低亦可能与其茎尖分生组织中