海带褐藻糖胶磺化工艺研究

海带褐藻糖胶磺化工艺研究【摘要】目的优选海带褐藻糖胶(FPS)磺化的工艺。方法以氯磺酸－N,N-二甲基甲酰胺(DMF)为磺化试剂，采用正交设计法,考察反应时间、反应温度及磺化剂用量对海带褐藻糖胶磺化反应的影响,找出制备高硫酸根含量海带褐藻糖胶的最佳方法。结果反应时间和反应温度对海带褐藻糖胶的磺化有显着影响(

【关键词】海带褐藻糖胶磺化硫酸根

Abstract:ObjectiveToexploretheoptimummethodforpreparationofsulfatedfucoidanextractedfromLaminariajaponica.MethodsUsingchlorsulfonicacidandDMFassulfatedreagent,testtheeffectofreactiontime,reactiontemperatureandvolumnofsulfatedreagentbytheorthogonaldesignmethod.ResultsReactiontimeandreactiontemperaturewerethesignificantfactors(<P<).hadwasReactionandtemperaturearesignificantfactors(<P<).Volumnofreagenthassomeeffectsonsulfation(<P<).Thebestprocesssetasfollows:thereactiontimeis3hat50℃with25mlsulfatedreagent.

Keywords:Laminariajaponica；Fucoidan；Sulfation；Sulfategroup

硫酸酯化多糖又称多糖硫酸酯，是多糖的衍生物。近年来研究表明,多糖经硫酸化后,本身富含硫酸根,易与蛋白质的特定结构域结合,由此改变其构像并影响其功能,使其具有多种生物活性,如增强机体免疫功能、抗肿瘤、抗病毒等,特别是抗艾滋病病毒活性引起许多研究者的极大兴趣，使硫酸酯化多糖的研究成为多糖研究领域内的一个新热点［1］。

褐藻糖胶又称褐藻多糖硫酸酯,是一种含有硫酸基的阴离子杂聚糖,一般存在于褐藻和一些棘皮动物体中,具有抗凝血、抗肿瘤、抗病毒、抗溃疡等独特的生物活性,近年来成为海洋药物的研究热点之一［2，3］。研究表明硫酸根的含量与生物活性有密切的关系。SatoruK等［4］研究了从墨角藻中提取的褐藻糖胶的抗肿瘤活性,结果表明过硫酸化的褐藻糖胶的抗肿瘤活性显着高于原料褐藻糖胶。以氯磺酸－吡啶为磺化试剂制得的褐藻糖胶的过硫酸化产物的抗凝血活性是原料的4倍［5］。从褐藻海黍子中提取的褐藻糖胶,磺化后,其高硫酸根组分对L－1210白血病有效果［6］。Haroun-BouhedjaF等［7］研究了从泡叶藻中提取的褐藻糖胶的生物活性,发现双硫取代的样品对抗凝血活性贡献较大,当硫酸根与褐藻糖的比值大于时,抗凝血活性效果较好。

海带Laminariajaponica是褐藻门海带目海带属的一种大型海藻,含有丰富的蛋白质、纤维素和矿物质,是一种经济价值很高的天然保健食品。从海带中提取出的褐藻糖胶也有许多独特的生物活性。我们前期的研究工作表明提高硫酸根的含量可以提高其体外抗氧化能力。因此本实验就海带褐藻糖胶的磺化反应进行了研究,考察了反应时间、反应温度及磺化剂用量对产物硫酸根含量的影响,从而优化海带褐藻糖胶的磺化工艺。

1材料与仪器1样品

干海带,购于青岛沙子口。2试剂

甲酰胺(AR)；N,N－二甲基甲酰胺(AR)；氯磺酸(AR)；95%乙醇；浓盐酸(AR)；明胶(AR)；氯化钡(AR)；氯化钾(AR)；氯化镁(AR)。3仪器

高压锅；FA1004电子天平；722型分光光度计；瑞士BüCHIR－114型旋转蒸发仪；东京理化EYELAFD－5N型真空冷冻干燥机；电热恒温水浴锅；TDL－40B离心机。

2方法

海带褐藻糖胶的提取将干海带用自来水清洗,除去泥沙,烘干,塑料袋封口室温下保存。取上述干海带100g,粉碎,用20倍蒸馏水在高压锅中提取3h,过滤,滤液加mol/L氯化镁和20%的乙醇沉淀,硅藻土过滤,加活性炭在沸水浴中脱色30min,硅藻土过滤,滤液中加%KCl和75%乙醇沉淀,离心,将沉淀在红外灯下烘干即得褐藻糖胶(FPS)［8］。

海带褐藻糖胶磺化方案设计反应时间、反应温度和磺化剂用量作为考察因素,每个因素拟定3个水平,选用L9正交表进行实验。表1正交实验因素水平

海带褐藻糖胶的磺化反应

磺化试剂SO3－DMF的制备在冰浴中将50ml氯磺酸缓慢滴加到300mlN,N－二甲基甲酰胺中，滴加完毕后室温搅拌30min，倒入棕色瓶中闭光保存。

磺化反应称取干燥的海带褐藻糖胶样品2g，倒入干燥的250ml三口瓶中，加入80ml甲酰胺，不同反应温度下机械搅拌30min，滴加不同剂量的磺化试剂SO3－DMF，反应指定时间。反应完毕后,将反应液倒出，在%KCl存在下,用75%乙醇沉淀,并用95%乙醇洗涤沉淀2～3次，将沉淀在红外灯下烘干，溶于100～150ml蒸馏水中，用2mol/LNaOH中和到pH为～，3600Da透析袋透析，自来水透析2d，蒸馏水透析1d。旋转蒸发至100ml，真空冻干［9］。

原料及磺化样品硫酸根含量的测定

标准曲线的制备1g明胶加100ml蒸馏水于60～70℃溶解，并在4℃下过夜，第2天把g氯化钡溶于溶液中，静置2h后使用。将硫酸钾于105～110℃烘3h，放干燥器中冷至室温，准确称取35mg左右，配成100ml溶液。配取标准液硫酸钾分别为0，,，，，，ml，加蒸馏水定容至3ml，加mol/LHClml，明胶氯化钡1ml，充分摇匀，放置30min后于500nm处测其吸光度。以标准硫酸钾浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,数据处理得到硫酸根含量标准曲线Y=9X+，r=6。硫酸根浓度在～mg/ml范围内线性关系良好［10］。

原料及磺化样品硫酸根含量的测定准确称取各种条件制备得到的磺化样品g左右放入安瓿瓶中，加2mol/LHCl8ml，待样品溶胀后，封管，在锅中水浴加热4h，取出冷至室温。把样品从安瓿瓶中取出，放入小烧杯中加氨水中和至pH=～后加活性炭，放置一段时间后用滤纸过滤，用蒸馏水慢慢少量冲洗，但不要超过25ml，然后定容至25ml。取样品溶液250μl，加蒸馏水定容至3ml，加mol/LHClml，明胶氯化钡1ml，充分摇匀，放置30min后于500nm处测其吸光度，与标准曲线对照得出样品中硫酸根的含量。

3结果

正交实验结果

结果见表2～3。直观分析得到，海带褐藻糖胶磺化反应的影响因素大小顺序为BCA，即反应温度磺化剂用量反应时间；最佳的磺化工艺为A2B1C3，即反应温度为50℃，用25ml磺化剂反应3h。方差分析可知温度和反应时间对实验结果有显着的影响，磺化剂用量对实验结果有一定影响。表2级差分析表3方差分析

平行实验及与原料褐藻糖胶中硫酸根含量的比较

以最佳磺化方案A2B1C3做3次平行实验，磺化样品中硫酸根含量为%，原料褐藻糖胶中硫酸根含量为%，即通过磺化反应使样品的硫酸根含量提高了%。

4结论

磺化后样品硫酸根含量比原料提高%，说明用SO3－DMF作为磺化试剂对褐藻糖胶进行磺化是可行的，从而避免了使用毒性较强的SO3－吡啶作为磺化试剂，方法简单，可用于制备保健品和药品。实验得到的海带褐藻糖胶磺化的最佳方案：2g样品溶于80ml甲酰胺中，用25mlSO3－DMF磺化剂在50℃反应3h。

【参考文献】

［1］向道斌，李晓玉.硫酸化多糖：一类治疗AIDS的新药［J］.国外医学·药学分册，1992，19：1.

［2］Pereira,MulloyB.,MouraoPA..Structureandanticoagulantactivityofsulfted.Comparisonbetweentheregular,repetitive,andlinearfucansfromechinodermswiththehetergeneousandbranchedpolymersfrombrownalgae［J］.JBiolChem，1999,274(12):7656.

［3］PreeprameS.,HayashiK.,LeeAnovelantiviralactivefucansulfatederivedfromanediblebrownalga,Sargassumhorneri［J］.ChemPharmBull，2001，49(4):484.

［4］SatoruK,NoboruT,HirooN,etal.Oversulfationoffucoidanenhancesitsanti-angiogenicandantitumoractivites［J］.BiochemicalPharmacology,2003,65(2)：173.

［5］XiangdongQiu,AnandaA,VasantD.Effectofoversulfationonthechemicalandbiologicalpropertiesoffucoidan［J］.CarbohydratePolymers，2005,65(2):224.

［6］YamamotoI.,TakahashiM.,SuzukiT..Antitumoreffectofseaweeds.Ⅳ.EnhancementofantitumoractivitybysulfationofacrudefucoidanfractionfromSargassumkjellmanianum［J］.JExpMed，1984，54(4):143.

［7］Haroun-BouhedjaF,ElloualiM.,Sinquinbetweensulfategroupsandbiologicalactivitiesoffucans［J］.ThrombRes,2000,100(5):453.

［8］纪明侯.海藻化学，第1版［M］.北京：科学出版社，1997：330.

［9］YuanHM,ZhangWW,LiXG.Preparationandinvitroantioxidan