酱腌菜咸胚中亚硝酸盐的测定 顶空-气相色谱法 征求意见稿编制说明

地方标准《酱腌菜咸胚中亚硝酸盐的测定顶空-气相色谱法》编制说明一、任务来源及背景说明本标准为地方标准制定项目，2023年由湖南省市场监督管理局立项，湖南省食品标准化技术委员会归口，下达文件：湘市监标函[2023]25号。酱腌菜产地甚多，湖南、浙江、福建等地均有大型的产业基地，酱腌菜生产企业近万家。据统计，2004年我国腌制品行业的年销售额在20亿元左右，到2017年榨菜行业规模达50亿元，2020年突破60亿元。我国腌制菜年出口量近20万吨，如日本蔬菜加工品中55%是腌制品;日本每年消费盐渍菜大约40亿美元，其中80%左右盐渍菜从我国进口。我省酱腌菜生产主要集聚在岳阳市，该产业蓬勃发展，作为主要经济支撑行业之一，现有大型企业湖南插旗菜业有限公司、湖南锦瑞食品有限公司、湖南李记食品有限公司等。但2022年央视“3·15”晚会腌制菜生产引发众多网友关注。其中，康师傅等企业老坛酸菜供应商湖南插旗菜业有限公司曝光，该企业标准化腌制池腌出来的酸菜，是用来加工出口产品的，而内销的老坛酸菜包里的酸菜，则是从外面收购来的“土坑酸菜”。事件过后，政府和企业启动对相关产品的下架回收，其带来的经济社会影响是巨大的。基于此，我院联合岳阳市检验检测中心启动关于酱腌菜系列标准的研究工作，以期保障产业可持续发展。目前国内关于酱腌菜有产品和卫生标准，如GB2714-2015食品安全国家标准酱腌菜、SB/T10439-2007酱腌菜、NY/T437-2012绿色食品酱腌菜、GB/T5009.54-2003酱腌菜卫生标准的分析方法等。亚硝酸盐作为酱腌菜的重要污染指标之一，现有检测方法主要为GB/T5009.33-2016《食品安全国家标准食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》，标准中包含三种方法：第一法离子色谱法，亚硝酸盐检出限为0.2mg/kg；第二法分光光度法，亚硝酸盐检出限:液体乳0.06mg/kg,乳粉0.5mg/kg,干酪及其他1mg/kg；第三法蔬菜、水果中硝酸盐的测定紫外分光光度法，硝酸盐检出限为1.2mg/kg。二、制定的目的和意义酱腌菜是湖南省岳阳市的特色食品，该产品以新鲜蔬菜为主要原料，采用不同的腌渍工艺制作而成的各种蔬菜制品。我国酱腌菜生产的历史悠久，品种繁多，是人民群众喜爱的一种佐餐食品。硝酸盐和亚硝酸盐作为常用食品添加剂中的发色剂和防腐剂，广泛存在于此类食品中。而且在酱腌菜的生产过程中也会产生该类物质，随着腌制时间长短还会出现含量不一的现象。其原理在于蔬菜中常含有较多的硝酸盐，大量使用含氮肥料、除草剂，土壤中缺钼或干燥时节均可使农作物大量蓄积硝酸盐，其在还原性微生物作用下转化为亚硝酸盐。在蔬菜发酵初期酸性环境尚未形成，具有硝酸盐还原作用的杂菌将蔬菜中大量硝酸盐还原成亚硝酸盐，使产品中亚硝酸盐含量急剧升高。蔬菜在腌渍的一定时期由硝酸盐转化为亚硝酸盐，亚硝酸盐是一种强毒性物质，成年人一次性摄入3g即可致死，其对人体造成的危害，主要包括引起高铁血红蛋白症以及在人体内形成致癌物质亚硝胺。过多摄入的亚硝酸盐使红细胞亚铁血红蛋白氧化为高铁血红蛋白，导致全身出现缺氧反应，高铁血红蛋白在体内达到70%以上时将导致死亡。亚硝酸盐的长期摄入还会引起维生素A缺乏症。由亚硝酸盐引起的胎儿和婴儿组织性缺氧，严重时会危及生命。食品中的亚硝酸盐已引起人们足够的重视，经过联合国粮农组织（FAO）和世界卫生组织（WHO）食品添加剂委员会的数次修订，在2002年亚硝酸盐的每日允许摄入量（ADI）被建议为每千克体重0~0.07mg。此外，欧共体建议婴儿食品中不得使用亚硝酸盐。亚硝酸盐和硝酸盐已成为食品质量安全中重要的检测指标。中国《食品安全国家标准食品中污染物限量》GB2762—2022中规定，腌渍蔬菜亚硝酸盐（以NaNO2计）不超过20mg·kg-1。中国《绿色食品酱腌菜》标准（NY/T437—2012）中规定亚硝酸盐（NaNO2计）≤4mg·kg-1。目前，酱腌菜中亚硝酸盐的检测主要采用GB/T5009.33-2016第二法分光光度法，该方法操作相对繁琐，能影响最终测定结果的因素较多，其准确性易受操作环境、检测人员等的影响，且该方法检出限高，亚硝酸浓度较高时，重复性差，平行性不好。第一法为离子色谱法，带电导检测器的离子色谱法受基体、温度影响较大，而且有大量氯离子存在下无法测定亚硝酸盐，使用率也就不高。其他检测ＮＯ－2和ＮＯ－3的方法如荧光法，该方法灵敏，但有些物质的存在会增加或降低荧光强度导致相对标准误差增大，特别是酱腌菜成分复杂。现阶段没有任何标准采用顶空-气相色谱法对酱腌菜亚硝酸盐的检测，我院积累历年检测和科研经验，发现该方法前处理简单，检出限低，准确度和灵敏度高，干扰小，重复性好，可以大批量检测酱腌菜中的亚硝酸盐，更好缩短检测时限，更好为我省酱腌菜企业提供服务保障。因此本文件旨在建立顶空-气相色谱法测定酱腌菜中亚硝酸盐，包括样品制备和检测的方法，该方法确立填补顶空-气相色谱法测定酱腌菜亚硝酸盐检测标准的空白，同时为进一步对国标食品中亚硝酸盐测定方法的制修订提供技术支持。三、制定标准工作简介1、主要工作过程 本标准的编制工作从2023年3月开始，由湖南省产商品质量检验研究院食品检验部具体承担。本标准制定严格按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》要求进行。从接到标准的编制任务开始，参加编写的人员就开始收集酱腌菜中亚硝酸盐的相关资料。包括收集亚硝酸盐的文献和各类标准、酱腌菜中亚硝酸盐检测方法相关文献，组织编制组成员多次讨论研究，初步确定酱腌菜亚硝酸盐的试验方案。其次，编制组成员通过探究性试验，优化色谱条件等，确定了试验方案。并对试验方案进行反复确证研究，包括精密度试验、回收率试验、实际样品检测，确定了最终试验方案。项目组经过多次讨论修改，初步形成了标准征求意见稿。再次，项目组就标准草案征求了广电计量检测（湖南）有限公司、岳阳市检验检测中心、怀化市检验检测中心等检验机构或公司相关技术专家的意见。最后，项目组对各方专家顶空-气相色谱法对酱腌菜中亚硝酸盐的测定方法地方标准的意见和建议进行了充分讨论研究，形成了《酱腌菜咸胚中亚硝酸盐的测定顶空-气相色谱法》征求意见稿。2、标准主要起草人及分工见表1表1主要起草人及分工序号起草人所在单位主要工作1曾小明湖南省产商品质量检验研究院项目负责人2吴海智项目总体联络与沟通3袁列江技术指导4上官佳标准文本编写5苏家佑企业联络与沟通6程梦雅实验操作7何浩实验操作8朱礼岳阳市检验检测中心主要研究人员9朱明扬主要研究人员10张鹏斐怀化市检验检测中心主要研究人员四、标准编制原则本标准的编制遵循GB/T1.1-2020《标准化工作导则—第1部分：标准化文件的结构和起草规则》和GB/T20001.4-2001《标准编写规则第4部分：化学分析方法》的要求编写制订，标准编制遵循“科学性、实用性、统一性、规范性”的原则，重点突出在方法准确性、可操作性，并注重标准的统一性和规范性。五、标准的重要内容说明1范围本文件规定了酱腌菜咸胚中亚硝酸盐的测定方法。本文件适用于顶空-气相色谱法测定酱腌菜咸胚中亚硝酸盐。2原理在酸性条件下，环已基氨基磺酸钠和亚硝酸钠在酸性条件下反应生成环己醇，环己醇在酸性条件下又继续与亚硝酸钠发生酯化反应生成环己烯，环己烯在常温下成气态，采用顶空气相进样系统进行定量检测。根据环己烯色谱响应值与亚硝酸盐浓度成正比，计算出酱腌菜咸胚中亚硝酸盐含量。3实验方法的确定与验证3.1检测方法的确定酱腌菜中亚硝酸盐通过顶空-气相色谱进行分离，采用FID进行检测。以亚硝酸钠作为标品，样品处理液中先后加入环己基氨基磺酸钠溶液和硫酸溶液，在顶空瓶中５０℃条件下发生重氮化反应，以衍生产物环己烯作为目标产物，定量分析进行定量测定。3.2标准溶液的配制3.2.1亚硝酸钠标准储备溶液（200ug/ml）（以亚硝酸钠计):准确称取0.1000g于110℃~120℃干燥恒重的亚硝酸钠，加水溶解，移入500mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。3.2.2亚硝酸钠标准使用液A(1.0ug/mL)：临用前，吸取2.50mL亚硝酸钠标准储备溶液，置于500mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。3.2.3亚硝酸钠标准使用液B(0.05ug/mL)：临用前，吸取5.00mL亚硝酸钠标准溶液，置于100mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。3.3试样前处理的要求试样前处理方法参考GB/T5009.33-2016《食品安全国家标准食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》具体如下：称取3g(精确至0.001g)匀浆试样,置于250mL具塞锥形瓶中,加5mL50g/L饱和硼砂溶液,加入70℃左右的水约60mL，混匀，于沸水浴中加热15min，取出置冷水浴中冷却，并放置至室温。定量转移上述提取液至100mL容量瓶中，加入2mL106g/L亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加入2mL220g/L乙酸锌溶液，以沉淀蛋白质。加水至刻度,摇匀,放置30min,除去上层脂肪,上清液用滤纸过滤,弃去初滤液30mL,滤液备用。3.4仪器测定条件的选择和优化3.4.1方法原理被测样品溶液置于密封的顶空瓶中,在恒定的温度和硫酸介质中,样品中的亚硝酸盐与环已基氨基磺酸钠反应生成环己烯,环己烯在常温下成气态,用带有FID检测器的气相色谱仪进行分析,以保留时间定性。本文件分别考察了色谱柱类型、环己基氨基磺酸钠浓度、硫酸浓度、平衡温度、平衡时间的影响，优化试验条件。3.4.2气相色谱条件色谱柱参考选择石英毛细管柱(10%二甲基聚硅氧烷)，本文件中分别选用了DB-1(30m×0.32mm×0.50um)、DB-624(30m×0.32mm×1.8um)进行试验，保留时间分别为2.481min和3.333min，分离良好。3.4.3标准曲线及方法检出限―配制亚硝酸盐浓度依次为0、0.015、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.0、2.0、3.0ug的标准系列,用外标法绘制出浓度–峰面积校正曲线，见表1。相关系数r=0.9995,回归方程F(x)=12607x-42.963。本研究选用3倍信噪比为判断标准,若取3g样品测定,测得亚硝酸盐的最低检出浓度0.10mg/kg，当样品含量较高时,可减少取样量或者减少进样量。3.4.4对环己基氨基磺酸钠浓度为10mg/L时,分别加入0.50、1.00、1.50、2.00和2.50mL进行测定,结果显示当环己基氨基磺酸钠加入量在1.00mL以上时信号响应不再随环己基氨基磺酸钠的含量增加而升高,实验时选择1.00mL。3.4.5硫酸主要是给亚硝酸盐酯化提供酸性环境,经实验加入100g/L硫酸0.50、1.00、1.50和2.00mL对检测器的信号响应值没有明显影响,选择使用1.00mL100g/L硫酸。3.4.6一般来说,平衡温度越高,分析灵敏度越高,但过高的平衡温度又会产生大量的水蒸气,反而会降低响应值。选择在2.50mL样品中加入等量的标准溶液,在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃条件下平衡30min,在同一色谱条件下分析。结果表明随着温度的升高,响应值一直在增大,但温度过高,水量也在逐渐增大,会对检测器有损害,因此在能满足检测限的要求下,选择尽量低的保温温度,最终选择50℃即可满足要求。3.4．7待测物质在气液两相达到平衡状态需要一定的时间,选择在10mL样品中加入等量的混合标准溶液,在50℃条件下设平衡时间为10、20、30、40和50min,在同一色谱条件下分析。结果表明环己烯的峰面积随着平衡时间的延长先增加然后趋于平缓,30min后峰面积变化不明显,故本方法先用30min为平衡时间。3.5方法验证3.5.1线性回归方程、线性范围、检出限和定量限按照仪器工作条件以亚硝酸钠含量（ug）为横坐标，其对应的响应值峰面积为纵坐标绘制标准曲线，目标物的线性浓度范围为0.015～3ug，相关系数大于0.9990；以3倍、9倍信噪比（S/N）计算方法的检出限（3S/N）和定量限(9S/N)，本方法的检出限和定量限结果见表2。表2线性回归方程、线性范围、检出限和定量限标准溶液亚硝酸钠质量（ug）峰面积标准曲线信息浓度（ug/mL）进样体积（mL）0.050000.300.0152120.400.022701.000.056702.000.1010381.00.200.2025440.500.5062281.001.00127692.002.00244313.003.0038209线性回归方程F(x)=12607x-42.963线性相关系数0.9995方法检出限0.1mg/kg方法定量限0.3mg/kg顶空气相色谱法测定酱腌菜中亚硝酸盐，取样量为3g时，检出限为0.1mg/kg，方法定量限为0.3mg/kg。3.5.2加标回收率按照上述试验方法对样品进行3个浓度水平的加标回收试验，每个浓度水平平行测定3次，结果见表3。结果显示，3个加标水平下的回收率为97.2%~103.4%，相对标准偏差（RSD，n=3）为0.446%~2.61%；表明本方法具有良好的准确度和精密度。表3加标回收率样品名称样品质量（g）加标量（ug）实际样品亚硝酸钠含量mg/kg测定值mg/kg回收率（%）RSD（%）酱腌菜（辣椒酱）3.2937350.05511.0393103.40.9783.091311.6585102.53.144911.3454101.43.02526019.423597.72.613.086119.8568101.93.175918.426397.23.008512040.8310102.20.4463.227938.2540102.83.518735.2176103.13.5.3方法的重复性重复性是重复条件下的精密度，同一实验室，同一人操作，使用相同的设备，用同样的方法分别获得独立测量结果。分别对酱腌菜1（酸豆角）和酱腌菜2（剁辣椒）重复检测6次，并根据标准曲线计算样品中亚硝酸钠含量。对比结果计算RSD，两种酱腌菜样品的RSD为2.15%与2.81%，结果表明方法稳定，重复良好。具体数据见表4。表4方法重复性酱腌菜1（酸豆角）酱腌菜2（辣椒酱）样品质量（g）样品中亚硝酸盐含量（mg/kg）RSD(%)样品质量（g）样品中亚硝酸盐含量（mg/kg）RSD(%)3.18966.832.153.00131.512.813.28866.653.02681.523.26616.993.08921.513.44806.683.03541.603.27066.953.20121.593.26536.953.01781