南方红豆杉紫杉醇的生产

南方红豆杉紫杉醇的生产

子松醇是一种含有糊精素的复合氨基酸。它是从蘑菇科蘑菇植物的树皮和针叶等相关组织中提取的生代产物。它是世界著名的光谱和活性物质。它能够促进微管蛋白的合成,而微管蛋白可以和微管蛋白质相结合形成稳定的维管,从而阻止维管的解聚,“冻结”有丝分裂过程中的纺锤体,让肿瘤细胞停留在G2期和M期中间,抑制肿瘤细胞的复制,进而阻止癌细胞的增殖,逐渐缩小肿瘤的体积,而不是直接把癌细胞杀死。它是现阶段唯一可以控制癌细胞生长的植物药物。迄今为止,紫杉醇及其类似物只发现于裸子植物红豆杉科红豆杉属及澳洲红豆杉属植物中。红豆杉属植物广泛分布于全球,大概有11种,我国有4个种和1个变种。南方红豆杉Taxuschinensisvar.mairei别名为美丽红豆杉,是红豆杉科红豆杉属植物,是中国红豆杉的一个变种,特产于我国,且广泛分布于我国南方各省区。由于该物种在自然界中罕见,且其自然繁殖能力很低,现已处于濒危状态,故被我国列为一级保护植物。它不仅具有重要的药用与遗产价值,还具有较高的观赏和材用价值。南方红豆杉是我国红豆杉属植物中紫杉醇含量较高的一种,其枝叶、茎皮、根、种子、果肉等组织中均含有紫杉醇,其根皮中紫杉醇的含量最高,达到0.0178%。但是,南方红豆杉的生长极其缓慢,原料供应极其匮乏,且其紫杉醇含量较低,故组织与细胞培养就成为原料生产的重要途径之一。为了解决紫杉醇供不应求的问题,前人在细胞悬浮培养的基础上进行了大量的试验,以期建立一个高产紫杉醇的悬浮体系。然而,组织与细胞培养的首要条件是获得愈伤组织,高产紫杉醇的关键是建立优良的细胞悬浮体系。因此,文中就通过南方红豆杉愈伤组织的诱导、细胞悬浮培养而生产紫杉醇的研究现状与研究进展进行了综述,分析了南方红豆杉组织与细胞培养研究中存在的问题,以期为促进南方红豆杉的细胞培养生产、资源保护和发展提供一定的理论基础与技术指导。1细胞悬浮与愈伤组织分离诱导出符合要求的愈伤组织是组织培养和细胞悬浮培养成功的关键。组织培养要求愈伤组织具有较高的分化能力,以便于后续的分化和再分化;而细胞悬浮培养则要求它结构较松散,以利于悬浮培养。前人已经做了大量的有关愈伤组织诱导的试验,大多数试验者都得到了愈伤组织,但在愈伤组织继续培养过程中却普遍出现了褐化且难以分化的现象。愈伤组织的诱导主要受外植体、基本培养基和激素等因素的影响。1.1南方红豆外植体的诱导率袁梦如等人用南方红豆杉的幼芽、幼茎和幼叶作为外植体,比较分析了不同外植体诱导愈伤组织的效率,同时对愈伤组织增殖的条件和悬浮细胞培养的条件进行了探索,结果发现:在相同的培养基上,幼芽、幼茎和幼叶的诱导率(分别为90%、85%、20%)各不相同,这证明了幼茎的诱导率高于幼叶这一结论。这一试验结果也表明,幼芽、幼茎和幼叶诱导愈伤组织的效率从大到小依次为:幼芽>幼茎>幼叶。Fott-Neto等人选取东北红豆杉的种皮、种子、幼茎和针叶作为外植体,研究了它们诱导愈伤组织的能力,结果表明幼茎是最佳的外植体;陈惠等人以采摘于山西陵川野生南方红豆杉上的幼嫩茎段、老茎段、针叶切段为外植体,将它们培养在相同的培养基上,结果发现,幼茎产生愈伤组织的时间最早,且其诱导率最高,这和Fott-Neto等人的研究结果是一致的。张芳芳等人选用了3种类型的南方红豆杉外植体:(1)去除了外种皮的成熟种子,在无菌滤纸上将胚剥离;(2)茎段,切成0.5~1.5cm长的小段;(3)侧芽,先剥去少数外鳞,再用剪刀稍稍减碎。他们将上述外植体接种到添加了2,4-D的MS培养基上,结果发现,种胚的诱导率较高且愈伤组织的污染率较低。Lee等人认为,红豆杉的胚是诱导愈伤组织的最佳外植体;而赵冬等人却认为,嫩茎比针叶更适合作为外植体。他们在实验中发现,南方红豆杉的嫩茎比较容易产生高质量的愈伤组织:首先是茎的两端膨大变白,叶柄的切口处产生愈伤组织,接着整个茎膨大,最后整个外植体可以全部转化成愈伤组织。这与前人的研究报道是一致的。李斌连等人以嫩茎、叶片、侧芽、茎尖为外植体,研究了不同外植体对南方红豆杉愈伤组织诱导的影响情况,结果发现:不同的外植体对愈伤组织的诱导在数量上差别不大,但侧芽的污染率很低,由其诱导出的愈伤组织颜色较浅,而且出愈时间较早;嫩茎和叶片的污染率在85%左右,其诱导的愈伤组织颜色浓绿,继代培养时容易发生褐变。由此看来,侧芽是诱导南方红豆杉愈伤组织的最佳外植体。王德强等人认为,茎、叶、根诱导愈伤组织的能力从大到小依次为:茎>叶>根。他们在实验中发现,外植体的大小对愈伤组织的形成影响显著,带有部分叶的茎段不能形成愈伤组织,而带有根的茎段则可以诱导愈伤组织。综上所述,在南方红豆杉愈伤组织的诱导过程中,经常采用的外植体包括茎段、侧芽、叶片、种胚和根这5种,它们诱导愈伤组织的能力由高到低依次为:种胚>侧芽>茎段>叶片>根。1.2培养基对南方红豆愈伤组织的诱导赵冬等人研究发现,MS和B5都可以诱导嫩茎产生愈伤组织,但是,用相同的激素组合处理后,B5诱导愈伤组织的能力比MS高3~4倍,且B5培养基中的愈伤组织萌动较早。Lee等人在进行红豆杉胚培养时发现,以B5为基本培养基的培养效果较好。王德强等人以幼叶和幼茎为外植体,对其在MS、B5、N6、SH这4种培养基上诱导愈伤组织的情况进行了研究,结果发现:它们在MS上产生愈伤组织最快,只需7d左右,但培养20~30d后愈伤组织会逐渐褐化;在B5上培养8~10d后开始出现愈伤组织,且其比在MS培养基上出现的要紧密些,培养20d后有少量的褐化,但褐化程度比在MS培养基上出现的低;而其在SH培养基上较难形成愈伤组织,培养60d后仍然没有变化,也没有发生褐化;N6培养基上的外植体在培养20d后形成了愈伤组织,且其结构紧密,褐化少。不同种类的培养基,因其组分不同,故其对南方红豆杉愈伤组织的诱导效果也有所不同。常用的基本培养基有MS、1/2MS、B5、N6、SH、WPM这几种,大部分文献资料显示,在黑暗条件下培养时,B5诱导愈伤组织的效果较好。在选择基本培养基时,要从形成愈伤组织时间的快慢、产生的愈伤组织是否适合后续工作、愈伤组织是否容易褐化及紫杉醇含量的高低这4个方面来考虑。1.3培养基对愈伤组织的诱导苏应娟等人在MS培养基上进行了南方红豆杉芽愈伤组织的诱导和培养实验,得到了芽诱导的最适培养基,即MS+2,4-D2.0mg/L+NAA0.5mg/L。他们在实验中发现,在添加了KT的组合中,芽不能产生愈伤组织,即使偶尔出现愈伤组织也很快褐化;茎段愈伤组织的产生也因为加入了KT而延迟,且诱导率也有所降低。陈惠等人在实验中发现,诱导愈伤组织的最佳培养基为MS+2,4-D4.0mg/L+KT1.0mg/L或B5+2,4-D3.0mg/L+KT0.1mg/L+Phe(苯丙氨酸)0.1mol/L,它们的诱导率均可达到100%。当2,4-D的质量浓度适宜时,与在MS培养基上出现的愈伤组织相比,在B5培养基上出现的愈伤组织褐化轻而生长快。盛长忠等人的实验结果表明:2,4-D比NAA更有利于愈伤组织的形成,在培养基中加入同等浓度的2,4-D和NAA,前者的诱导率在95%以上,明显高于后者。他们在观察愈伤组织中发现,在含有2,4-D的培养基上,愈伤组织颜色较新鲜,且块大、松软,而在含有NAA的培养基上,愈伤组织块小、褐色、较硬。他们在实验中还发现,向培养基中添加适当浓度的水解酪蛋白、苯丙氨酸和乙酸钠,能有效促进南方红豆杉愈伤组织的生长和紫杉醇的积累。荣俊冬等人在对南方红豆杉愈伤组织的培养研究中观察发现:用2.0mg/L的2,4-D处理过的叶、茎,其愈伤组织的诱导率高于用1.0mg/L或0.5mg/L的2,4-D处理过的,在添加了2,4-D的培养基上,愈伤组织的诱导率远远高于没有添加的,且添加的最适浓度是2.0mg/L。赵冬等人研究认为,在B5培养基中添加2.0mg/L的2,4-D和0.5mg/L的6-BA,是最适合诱导茎段愈伤组织的培养的,其诱导率达76.0%,且愈伤组织的质量好、块大、松散,适合后续的液体悬浮培养。他们在实验中发现2,4-D比NAA更有利于愈伤组织的形成,这与盛长忠等人的研究结果是一致的。而且,愈伤组织的状态也有较大的差异:在添加了2,4-D和6-BA的培养基上,愈伤组织体积较大且疏松,呈浅绿色;而在添加了NAA和6-BA的培养基上,愈伤组织的体积较小且致密,颜色较深。李斌连等人的试验结果表明:南方红豆杉愈伤组织诱导的最佳培养基是B5+2,4-D2.0mg/L+NAA1.0mg/L+IAA0.2mg/L。杜亚填等人研究发现,在MS培养基上,当2,4-D/NAA高于0.4时,这一条件对南方红豆杉愈伤组织的诱导不利。在诱导南方红豆杉愈伤组织时,使用的激素种类较多,常用的有2,4-D、NAA、KT、6-BA、IAA这几种。单独使用时,2,4-D的诱导效果优于NAA;当2,4-D的浓度在0.1~5.0mg/L时,添加的浓度越高,越有利于愈伤组织的诱导;混合使用时,要注意控制分裂素和生长素的比例,一般将2,4-D和6-BA或NAA混合起来使用。2基本培养基前人的大量实验结果证明,南方红豆杉细胞悬浮培养效果以B5培养基为基本培养基的为最佳。有关细胞悬浮培养高产紫杉醇的研究涵盖面广,主要包括前体饲喂、添加抑制剂、添加诱导子、调整植物生长调节剂的比例和有机碳源的浓度、添加无机盐和有机附加物及促进剂组合等方面。2.1前体化合物的影响前体饲喂既可以通过增加底物量来加快反应速率和提高产量,还能通过反馈抑制其他的分支路径来促进反应的顺利完成,从而有效地提高紫杉醇的产量。常见的前体有丝氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、苯甲酸等物质,有关研究结果表明,这些前体物质在红豆杉细胞悬浮培养过程中都能较好地促进紫杉醇的合成。吴兆亮等人研究了南方红豆杉细胞双液相培养中前体饲喂和混合糖源这种生产培养基糖源对细胞生长和紫杉醇合成的的影响情况,结果表明:前体饲喂(苯丙氨酸、苯甲酰胺和醋酸钠)或混合糖(麦芽糖和蔗糖)作为生产培养基糖源,其对提高南方红豆杉细胞双液相培养的紫杉醇产量有显著的促进作用,而且前体饲喂和混合糖源的协同作用对其双液相培养中紫杉醇产量的提高也有进一步的促进作用。2.2单合成二在红豆杉细胞悬浮培养过程中可以添加一些如樟脑、松油醇、a-蒎烯等单萜合成抑制剂,这些抑制剂可在一定程度上阻止能量和物流过多地流向单萜3个旁路途径,使更多的能量和物流集中到由单萜合成二萜的途径中来,从而提高紫杉醇的产量;且三者协同作用的效果更好。2.3紫杉醇的诱导生物固定在红豆杉细胞悬浮培养中经常使用的诱导子主要有两种:一种是非生物诱导子,包括化学协同物质(茉莉酸甲酯、花生四烯酸、水杨酸、甲基茉莉酮酸等物质)和一些人工合成化合物(苯甲酸等化合物);另一种是生物诱导子,通常为经过高压灭活的细菌、真菌、酵母的细胞壁萃取物。在红豆杉悬浮培养体系中添加适量的诱导子,可有效刺激植物防卫系统,从而促进紫杉醇的代谢,同时使诱导得到的产物分泌到培养基中。茉莉酸甲酯(MethylJasmOnate)是一种常见的极其重要的诱导子,广泛存在于植物防御信号的传递途径中,在细胞的信号转导系统中承担着极其重要的任务。一些科学家认为,加入茉莉酸甲酯的初始时间及浓度对紫杉醇的生物合成有着重要的影响;他们研究发现,想要进一步提高紫杉醇的产量,就要把茉莉酸甲酯和花生四烯酸结合起来作为一种诱导子,这比它们单独作用的效果会更理想。水杨酸与硝酸银的协同作用对紫杉醇产量的提高也有较显著的影响,而水杨酸与花生四烯酸协同作用的效果却比前者差。王艳东等人研究发现,甲基茉莉酮酸不仅能促进细胞初生代谢提前向次生代谢转化,并且能够增强细胞的次生代谢,有利于细胞相关次生代谢产物的合成。除此以外,在培养基中添加苯丙氨酸或甲基茉莉酮酸或水杨酸,均可提高愈伤组织中紫杉醇的含量。藏新等人研究认为,低浓度的油菜素内酯(BR)对于细胞生长具有轻微的促进作用;他们还认为,BR在最适宜的诱导浓度范围内对培养细胞没有毒害作用。因其用量少,价格低廉,故可以考虑将其用于大规模的红豆杉细胞培养生产紫杉醇这一领域之中。真菌诱导物大多数可以在一定程度上提高紫杉醇的含量,但其会强烈抑制红豆杉的细胞生长。张长平等人和余龙江等人在悬浮培养南方红豆杉细胞体系研究中发现,当细胞进入指数生长末期时加入真菌诱导子,次生代谢产物中紫杉烷类的生物合成均得到了加强,其中紫杉醇的含量达到67mg/L,是对照组的5倍左右。2.4紫杉醇对细胞生长和紫杉醇产量的影响为了有效地提高紫杉醇的生物合成量,需要对生长素和分裂素的比例作适当的调整。Fett-neto等人的研究结果表明,适宜的KT和2,4-D的比例能够有效地促进细胞的生长和紫杉醇产量的提高。另外,甘烦远等人在实验中发现,低浓度(0.5~1.0mg/L)的2,4-D更有利于紫杉醇的合成,而较高浓度(l.0~2.5mg/L)的2,4-D则对细胞的生长比较有利;使用NAA后紫杉醇产量的变化与使用2,4-D后的结果大致相同,但是,使用IAA比使用2,4-D更能提高次生代谢产物紫杉醇的产量。2.5蔗糖浓度对紫杉醇含量的影响Kim的研究结果表明:不论使用哪种糖分,其最适浓度都是6%;高产紫杉醇的最优碳源是果糖,它对细胞的生长有较好的效果;甘露醇和山梨醇虽不能促进细胞的生长,却能促使紫杉醇的大量合成。甘烦远等人的实验结果表明:当蔗糖浓度在20~30g/L的范围内时,红豆杉细胞的长势良好;但是,当蔗糖浓度达到40g/L时,紫杉醇的含量最高,同时对细胞的生长也有利;而向悬浮培养体系中加入葡萄糖却会抑制紫杉醇的合成。晏琼等人的实验结果表明:在南方红豆杉细胞悬浮培养体系中补充添加果糖对细胞生长状态和紫杉烷合成具有显著作用,其会引起细胞的生理状态发生改变,而且蛋白质(代表酶的含量)的含量有明显的提高,目的产物紫杉醇(Taxol)被大量合成,其产量在摇瓶和反应器体系中最高分别达到81.0和71.7mg/L。2.6细胞内的磷酸盐平衡Ketchum等人对红豆杉细胞悬浮培养中氮、磷等无机盐的吸收状况及其对细胞生长和紫杉醇产量的影响情况进行了研究,结果发现:在细胞生长初期(0~6d),培养液中的磷酸盐就被迅速、大量地吸收了;到了中期(18d),几乎变成零;但到后期,在培养液中仍然可以检测到磷酸盐。这个结果也说明了,后期细胞中的磷酸盐已逐渐渗透到外面的培养液中。苏应娟等人在研究稀土和氮源对南方红豆杉的细胞生长和紫杉醇产量的影响情况后发现:当NH4+和NO3-的质量浓度比等于1且培养液中总氮源的浓度达到27mmol/L时,细胞的生长速率和紫杉醇的产量都达到最大值。另外,甘烦远等人在进行细胞悬浮培养时发现:向悬浮体系中添加适量的如水解乳蛋白(LH)、酪蛋白氨基酸(CA)或者椰子汁(CM)等有机添加剂,都能使紫杉醇的产量得到提高;而且CA和CM的添加对于提高细胞生长率也有促进作用。2.7柠檬酸三铵系对中国杉醇品质的影响李干雄等人在进行中国红豆杉细胞悬浮培养时发现:蔗糖、柠檬酸三铵、硝酸银、氨基酸前体和水杨酸组合对细胞的生长和紫杉醇的积累都有一定的影响,在悬浮培养之始加入1.67mg/L的硝酸银,第9天加入10g/L的蔗糖,第9天添加1540mg/L柠檬酸三铵时,紫杉醇含量达到最高,经过这个最优组合的处理,紫杉醇的质量浓度达到39.2mg/L,比最差组合(2.1mg/L)处理的提高了18.7倍。李干雄、李志良等人在进行中国红豆杉细胞悬浮培养时发现:氨基酸前体、水杨酸与硝酸银和D-果糖的添加时间对悬浮培养的中国红豆杉细胞的生长几乎没有什么影响,但能显著促进次生代谢产物——紫杉醇的生物合成;在悬浮培养的第14天向培养液中加入1.67mg/L的硝酸银,第18天加入0.1mg/L的水杨酸,第21天加入氨基酸前体,第21天再加入10g/L的D-果糖及2mg/L的硫酸镧时,其对紫杉醇的促进作用最为理想,经过这个最优组合的处理后,紫杉醇的质量浓度可以达到10.05mg/L,比经最差组合处理后紫杉醇的含量(1.77mg/L)提高了5.7倍。3诱导愈伤组织的纯化目前,关于南方红豆杉愈伤组织诱导和细