临床检验学基础

临床检验学基础绪论

目前,我国临床医学检验(clinicalmedicallaboratory)的设置,主要包括临床生物化学、临床血液学、临床微生物学、临床免疫学、临床分子生物学和临床检验基础。由于临床医学检验与临床医学日益结合,因此已形成了包括实验诊断学在内的临床检验医学(clinicallaboratorymedicine)。临床检验基础是一门高度综合性的应用科学,是临床医学和实验室医学的桥梁学科,是前期课程的延伸,是医学检验五年制本科生的必修主干课程之一.近年来随着计算机,生物化学,分子生物学,生物医学工程学和电子技术等学科的发展,医学临床检验又吸收引进了大量的其他学科的先进技术,使临床检验工作在分析检测的速度和灵敏度上有了很大的提高,检测的方法学有了很大的发展.

主要内容:本门课程由一般血液检查,血栓与止血,体液检验,脱落细胞检验共十八章组成.

学习目标:本门课程的教学目的和基本技能训练要求是:通过对临床诊断应用较广泛的各种标本的检测,使学生对临床检验工作形成较深刻的理解,掌握各种实验室理论和操作技能,养成良好的实验室工作作风,为毕业后能从事临床检验技术工作和管理工作奠定良好的理论和实验室基础.

一.临床检验基础的现状和特点

临床检验,源于古代对尿液的感官检查,如尿液的颜色、气味等。17世纪荷兰Leeuwenhoek发明显微镜,跨时代地推动了医学走进微观世界。人们从认识静态的血液细胞形态开始,逐步深入到研究细胞的功能、大分子物质、基因的结构和功能,试图探究生命现象的本质。20世纪末以来,临床医学检验的加速发展,是现代物理学、化学、生物学、数学等学科之间相互交融的结果,特别是医学检验技术的进展,更直接映射出现代电学、电子学、计算机科学、光学等自然科学基础学科与生物化学、免疫学、细胞生物学、遗传学、分子生物学等生物医学基础学科杰出结合的光辉;而当前正在兴起的现代信息网络技术,又进一步实现了病理学、影象学等形态检查的远程医学传播,为临床医学及时提供了检测报告和实时交流。

临床检验基础,借助先进的检测技术,对来自离体的血液,尿液.粪便以及分泌物和排泄物等标本进行理学、化学、病原学和显微镜形态学的检查,以简便、快速的检测结果，基本满足临床医学检验筛检疾病的需求。近20年来,临床检验基础的发展具有以下鲜明的特征：1、从手工检测步入仪器自动化、电脑化检测。20世纪50年代初问世的血液分析仪,从仪器自动计数血液红细胞、白细胞几项参数开始,到如今发展到综合运用电学、光学、细胞化学等多种检测原理.具有复杂结构的中高档仪器,能同时提供全血细胞计数及其相关参数和(或)网织红细胞计数.”幼稚细胞”分类等多项参数。血液分析仪的特点包括:用血量少(以微升计)、检测快速(以分、秒计)、检测项目多(参数达20～40余项)、精度高(变异系数可低于1%)、自动质量控制(提供多种质量方式和质控图形)以及信息取存和联网系统。用于临床检验基础的检验仪器,还有尿液干化学分析仪、尿沉渣分析仪、血沉仪等。同样具有检测简便、快速、精密度高的特点。2.床边检测(pointofcaretest,POCT)这种检测方法省去了标本转运的程序，使检测的标本更新鲜、交叉污染率更低,更接近被检者当时生理或病理实际状态。床边检测标本用量更少、检测速度更快、检测场所更灵活、结果报告更及时(常立等可取),对检验者无需专门培训。干化学单项试带或多联试带尿液定性或半定量检测,是典型的床边检验实例。3.试剂批量化、配套化、专业化和多样化已有许多优质的商品化试剂应用于临床基础检验，包括瑞氏染色液，血液分析仪、止凝血检测用的配套试剂盒、尿液分析仪用配套的试带等。4.更加重视检验方法的标准化。当前，我国检验界十分重视对血液分析仪、尿液沉渣显微镜检查操作的标准化。目前，已经有血液分析仪的评价系统，保证了检测质量和各种仪器之间的可比性。对床边检测项目更要求标准化、规范化，对止凝血等各种商品化检测试剂，强调必须达到应有的检测灵敏度和特异性。5.实施全面质量管理和质量保证质量保证包括人员和物质两大方面。在人员方面，主要是检验人员的医德素质和技能素质。检验者必须有高尚的医德、熟练的技能；熟悉如何避免检验前、中、后影响检测结果准确性的各种因素和防止主要干扰内素的具体方法。检验过程中，检验人员必须作好严格的室内质量控制，并积极参与室间质量控制的活动，不断提高检验质量的准确性和可靠性。检验前，标本的采集和转运过程尤为重要；管理好这两个环节，可降低70%的检验差错率。检验用的标本通常有血液、尿液、粪便及其他体液。有些标本的采集，需用严格的消毒方法，并带有一定的创伤性。因此，检验人员应事先向患者解释，让患者充分理解、积极配合，从而获取合格的标本。（1）标本采集原则：留取标本的基本原则是保持离体标本采集质和量的完整性。任何离开人体的标本，要尽可能保持体内当时生理或病理的固有状态：使标本的有形部分（指一般能用普通光学显微镜观察到的成分，如各种细胞、虫卵等）和无形成分（指一般能溶解于液体，不能用显微镜观察到的化学物质，如蛋白质、葡萄糖等）的质和量基本不变。事实上，任何机体中的成分，一旦离开人体，则受到环境的影响，会发生改变。衡量标本是否新鲜的简单尺度，是从标本采集到检验所允许的时限。因此，标本越及时送检、越早完成检验，检验结果就越可靠。2）避免非疾病因素：非疾病因素造成检验结果异常的主要环节可分为3个阶段：第1阶段是在检测前，包括是否有合格的操作人员、合乎要求的标本以及被检测者当时的生理特征和状态；第2阶段是在实验检测中，包括具体的检测方法、仪器和试剂的质量等；第3阶段是检测后对结果的正确评价和解释。（１）生理变异：由生理因素引起检验结果变异比检测过程中产生的技术性变异往往更大。生理变异可分为两大类：一类是不能控制的，如年龄和性别，对检验的影响是长期效应；另一类是能够加以控制的，如食物、药物、情绪、活动状态、体位等，对检验的影响多为短期效应。年龄：一般而言，检测时应考虑四组年龄：新生儿、儿童期到青春期、成人和老年人。性别：不少检测项目的参考值，男女有别，即使在同一年龄阶段，也有明显的差异。这种情况主要反映在青春期后。例如：在15—40岁，男女的红细胞计数值不同，女性一般低于男性；妊娠期中后期，红细胞计数值随血容量增高和血液稀释可明显减低；红细胞沉降率，女性高于男性，如妊娠期3个月以上，可进一步增高。体位：直立时，血容量比卧位平躺时减少600—700ml。从卧位到直立时，血容量可减少10%左右。运动：对检验结果的影响程度，与运动的强度和时间长短有关。时间和状态变化：昼夜更替、睡眠与觉醒状态、暴热、寒冷、紧张，可使肾上激素分泌变化，从而引起血细胞数量、质量和许多物质浓度的改变。（２）饮食因素：如刚进食不久即作血液检测，可见血葡萄糖、脂肪浓度增高。长期素食者，尿液偏碱，血维生素B12接近缺乏，胆红素则较高。禁食、减肥者，血糖和胰岛素减低，血酮体可明显增高，血清许多酶活性增高，严重者还可发生酸中毒。饮酒者，产生轻度醉酒时，血葡萄糖浓度就可增加20%-50%。吸烟者，吸入一支烟，血糖浓度在10min内就可增加0.56mmol/L，可持续1h之久，红细胞计数、白细胞计数增高，精子计数减少，异形精子率增高，精子活动力减弱。（３）药物因素：口服方式，药效作用慢而持久；注射或吸入方式，药效作用快而短促。当出现了不可思议异常检验结果时，或与临床不符合时，应考虑是否有药物引起干扰。例如，高浓度维生素C，可使乳酸脱氢酶活性减低、尿干化学胆红素试验和尿糖试验假阴性，而使班氏尿糖测定假阳性。口服避孕药可影响许多试验的测定，也应特别注意。因此，对短期效应的生理因素进行有效的预控，是保证检验质量至关重要的环节。二、临床检验基础的应用目的1．为疾病诊断和鉴别诊断提供实验室筛检或确诊的客观依据如将血液分析仪和显微镜检查有机结合，可提供全血细胞数量和质量（形态）众多的参数和红细胞、血小板、白细胞异常的最基本的实验诊断信息。例如，白细胞（中性粒细胞）数量增高和血沉增高，支持急性心肌梗死的诊断，可与心绞痛鉴别；显微镜发现病原体，是确诊感染性疾病的依据。2．为疾病疗效监测和预后判断提供动态变化依据例如，尿液蛋白质检测对于肾脏疾病患者的病情估计、网织红细胞计数对于进行化学疗法和放射疗法的患者或贫血患者的骨髓功能判断均具有可靠而实际的指导作用。3．为预防疾病提供检测依据例如，从标本中检出寄生虫，可对感染人群进行必要的治疗和（或）隔离，防止疾病的传播和传染。4．为科学研究提供医学检验基本数据、基本检验方法和操作技能。三．学好临床基础检验的基本要求（5）1．掌握检验的基础理论包括检验项目涉及的生理、病理基础，特别是检验基本理论．2.掌握检验的实验技能临床检验基础的许多操作是进行其他临床医学检验的必要基础，包括标本采集、操作规范、质量控制等。因此，特别强调学生在实验课或在临床实习中动手能力的训练。

3.熟悉检验方法学的评价学会如何评估和选择灵敏度高、特异性好的检验方法，有时是恰如其分、正确地比较和认识手工检验方法和仪器检验方法的长处和短处。4.了解检验项目的参考值检验者应经常记忆最常用的检验项目参考值，以便结合临床，对检验结果进行有效的分析。现已用“参考值”代替过去常用的“正常值”。这是因为检验项目的测定结果，只能来自部分地区、部分健康人群的相对统计。再者，即使在选定的人群中，检验结果被纳入参考范围的也只占被检人群数的95%，还有5%人群末被统计在内。由于对每个患者发病前的基础检验值的情况了解甚少，所以仅凭一次出现“低于”或“高于”（特别是略低于或略高于）参考值范围的结果，并不能肯定为异常，通常至少应重复2次以上检验、并出现相同或相近结果时，才可认为检验结果可靠有效。5.熟悉检验项目的临床意义检验人员应用循证检验医学新思维指导临床检验，不断追求和采纳已经科学评价和证明了的、具有当时最佳临床价值的“金标准”检验项目和最佳检验方法，为临床提供有效的检验结果，要主动与临床保持联系，共同分析异常检验结果的原因。必须认识到，由于医学检验在时间上和空间上存在一定的局限性，因此，对任何检验结果均需慎重分析，才能作出符合实际的合理解释。第一章血液标本采集和血涂片制备第一节血液标本采集和抗凝剂选择

血标本分为全血、血浆和血清等。全血：由血细胞和血浆组成，主要用于临床血液学检查，如血细胞计数、分类和形态学检查等。全血标本的化学物质检查易受血细胞量增减的影响，现在的临床化学检查已较少使用全血标本。血浆：为全血除去血细胞的部分，用于血浆生理性和病理性化学成分的测定，适合临床生化检查，特别是内分泌激素测定；血浆除钙离子外，含有其他全部凝血因子，适合血栓和止血的检查。细胞内、外各种溶质成分和含量有差别。疾病时，血细胞内成分变化较小，但血浆中成分变化可很大。血清：是离体后的血液自然凝固后析出的液体部分，除纤维蛋白原等凝学因子在凝血时消耗外，其他成分与血浆基本相同，更适用于多数临床化学和临床免疫学检查。在少数项目检查，血浆和血清的测定也有些差别。一．采血方法

血标本的正确采集是获得准确、可靠实验结果的关键。在标本采集前，应仔细考虑实验的需要，决定采血方法、所需血量及选用合适的抗凝剂。血液标本的采集分为皮肤采血法、静脉采血法和动脉采血法。不同的采血法无论细胞成分或化学组成，都存在不同程度的差异，因此在判断和比较结果时必须予以考虑。所有的采血技术均要求保持血液标本的完整性。动脉血成分在全身几乎相同；而静脉血，由于组织或器官的不同，其在不同部位的成分也不同；动脉血含氧量明显高于静脉血。（一）静脉采血法

当所需血量较多或采用全自动血液分析仪测定时，通常使用静脉采血法（venipunctureforbloodcollection）。位于体表的浅静脉几乎均可作为采血部位，通常采用肘部静脉；如肘部静脉不明显时，可改用手背静脉或内踝静脉，必要时颈外静脉采血可用于小儿，但有危险性，以少用为宜。根据采血量多少可选用不同型号注射器，配备相应的针头。某些特殊检查，为避免血小板激活，要使用塑料注射器和硅化处理后的试管或塑料试管。注射器和容器必须干燥，抽血不宜过快，以免产生大量泡沫或溶血；采血后应先拔针头，然后将血液徐徐注入标本容器，否则易于溶血。采血前应向患者作适当解释，以消除疑虑和恐惧。如遇患者采血后发生晕厥，可让其平卧，通常休息片刻即可恢复。必要时可嗅芳香氨酊，针刺或指掐人中、合谷等穴位。（二）皮肤采血法

皮肤采血法（skinpunctureforbloodcollection）,曾长期被称为毛细血管采血法，所采之血实质是微动脉、微静脉和毛细血管的混合血，含有细胞间质和细胞内液。主要用于需血微量的检查或一般常规检查。多选择手指或耳垂采血部位采血。耳垂采血痛感较轻，操作方便，但血循环较差，受气温影响较大，检验结果不够恒定。世界卫生组织（worldhealthorganization,WHO）推荐取左手无名指指端内侧血液做血液一般检验。婴幼儿手指太小可用大拇趾或足跟采血。严重烧伤患者，应选择皮肤完整处采血，采血器以三棱针或专用“采血针”为好，特别是后者。为避免交叉感染，应严格实行一人一针制。（三）真空采血法

真空采血法（vacuumtubeforbloodcollection）,又称为负压采血法。国内外已生产专供医学检验使用的真空采血装置，有套筒式和头皮静脉式两种，后者还设计备有软橡皮套管式止血装置，穿刺回血后，即可将另一端的硬插管插入真空定量硅化的采血试管中，血液足量后，拔出硬插管即止血，当插另一真空定量试管时又可采血，整个采血过程无血液外溢和污染。血标本转运方便，特别适用于病房和野外流动采血；能避免对医护人员的感染和患者血标本间的交叉感染。封闭式采血的血样无需容器之间的转移，减少了溶血现象，能有效保护血液有形成分，保持待验血标本原始性状的完整性，使检验结果更近真实，为临床诊断提供可靠依据。非封闭式采血，血标本暴露于空气中，待验血标本易受空气中尘埃、微生物和二氧化碳等异物的污染。各种真空定量储存抗凝试管，根据需要标有不同的色码备用，适于不同的检验项目（表1-1）。但真空采血管价格较高，有待进一步降低成本。

真空采血容器色泽及应用范围

颜色抗凝剂应用范围灰草酸盐、氟化钠全血、血浆，抑制糖原分解的酶黄消毒容器绿肝素全血、血浆红血清蓝枸橼酸盐全血、血浆，凝血一般检查紫乙二胺四乙酸盐全血、血浆

钾盐用于血细胞、血小板和血液学检查

血液学检查[方法学评价]血液一般检查过去常用皮肤采血，其主要缺点是易于溶血、凝血和可能混入组织液。为了采血，局部皮肤揉擦对多数的检查项目都会有一定的影响；且采血针刺深度不一，个体之间皮肤厚度不同，难免有组织液混入而影响检查结果的准确性。皮肤采血检查结果重复性差、易发生凝块，现在多已该用静脉采血。开放式采血由于操作环节多、难于规范统一，在移液及丢弃注射器时可能造成环境污染。封闭式采血法操作规范，从静脉穿刺到血标本转运，整个过程血标本皆不与外界接触。既有利于标本的收集运送和保存，也有利于防止医院内血源性传染病的交叉感染和环境保护。[质量控制]血液标本的采集是分析前质量控制的重要环节。很多因素会影响到血液标本检测。１.患者患者的活动情况和精神状态、药物、年龄、性别、种族、标本采集的时间以及是否吸烟等都会明显影响检测结果。例如，正常人一日之间，白细胞数、嗜酸性粒细胞数、血小板数等均有一定的波动。２.采血血标本采集应规范操作，以减少误差。在采血前，应使患者尽量减少运动以保持平静；住院患者应在早晨卧床时取血。冬天，患者从室外进入室内，应等其暖和后再采血。①皮肤采血：应尽量避开有炎症、化脓、冻伤等皮肤损害部位处采血。皮肤出汗时，应先用干棉球擦干，以免稀释血液。采血时，不要挤压皮肤，血液应自然流出。②静脉采血：止血带压迫时间宜小于1min，若止血带结扎超过2min，大静脉血流受阻而使毛细血管内压上升，可有血管内液与组织液交流，能使相对分子质量小于5000的物质逸入组织液；随着压迫时间的延长，局部组织发生缺氧而引起血液成分的变化渐大，检查结果出现不应有的增高或减低。３.溶血血细胞内、外各种成分有梯度差，有的成分相差数十倍，故在采集、转移、保管和分离血细胞时应尽量避免溶血。发生溶血的主要原因有容器不洁、接触水、强力振荡和分离血细胞时操作不慎等。溶血标本不仅红细胞计数、血细胞比容降低；而且能使血细胞内、外成分混合，血浆、血清的化学组成产生变化，影响钾、镁、转氨酶、胆红素等多项指标的测定，使检查结果增高或减低，不能反映原始标本的实际含量。４.血标本处理血液标本采集后应立即送检，并尽快进行检查。血液标本的保存条件非常重要，不适当的保存环境直接影响实验结果。血浆在4℃保存24h后，某些凝血因子活性仅为采血后即时活性的5%（减少95%）。供血液分析仪进行细胞计数的血液在室温下保存，低温（4℃）保存可使血小板计数结果减低。因此，应根据实验项目确定最佳的保存条件。５.实验结果分析分析检验结果时，应特别考虑药物及饮食因素对检验结果的影响。此外，血液标本的分析应密切结合临床，例如，患者有严重腹泻或呕吐时，红细胞计数可因脱水而增高。二、抗凝剂选择

使用全血和血浆检查，通常采集静脉血，需要使用抗凝剂。所谓抗凝，是用物理或化学方法除去或抑制血液中的某些凝血因子的活性，以阻止血液凝固。这种能够阻止血液凝固的物质，称为抗凝剂或抗凝物质。检查的项目不同，所使用的抗凝剂也不同。实验室常用的抗凝剂和使用方法如下。

乙二胺四乙酸（ethylenediamine

tetraaceticacid,EDTA）盐常用其钠盐（EDTA-Na2-H2O）或钾盐（EDTA-K2-2H2O），能与血液中钙离子结合成螯合物，而使CA2+失去凝血作用，从而阻止血液凝固。Na2C10H14O8N2+Ca+→CaC10H12O8N2+2Na++2H+EDTA盐对血细胞形态和血小板计数影响很小，适用于多项血液学检查，尤其是血小板计数，但钠盐溶解度明显低于钾盐，有时影响抗凝效果。EDTA-K2特别适用于全血细胞分析及血细胞比容测定，室温下6h，红细胞体积不变。根据国际血液学标准化委员会（InternationalCommitteeforStandardizationinHematology,ICSH）1993年文件建议，血细胞计数用EDTA-K2作抗凝剂，用量为EDTA-K2-2H2O1.5-2.2mg/ml血液。EDTA影响血小板聚集，不适合于作凝血象检查和血小板功能实验。2.草酸盐（sodiumoxalate）常用的有草酸盐、草酸钾、草酸铵，他们溶解后解离的草酸根与标本中的钙离子形成草酸钙沉淀，使ca2+失去凝血功能。Na2C2O4+CaC2O4↓+2Na+

草酸盐抗凝的优点是溶解度好、价廉。2mg草酸盐可抗凝1ml血液。草酸钠通常用0.1mol/l浓度，与血液按1；9比例使用，过去主要用于凝血象检查。实践发现，草酸盐对凝血V因子保护功能差，影响凝血酶原时间测定，另外由于草酸盐与钙结合后形成的沉淀物影响自动凝血仪的使用，因此，多数认为，凝血象检查选用枸橼酸钠为抗凝剂更为适宜。高浓度钾离子或钠离子易使血细胞脱水皱缩，而草酸胺则可使血细胞膨胀，故测定血细胞比容时用草酸胺和草酸钾或草酸钠两者适当比例混合的抗凝剂，恰好不影响红细胞的形态和体积。若用草酸钾或草酸钠作抗凝剂，与肝素为抗凝剂测定的血细胞比容比较，测定值可降低8%-13%，此时的血浆量也相应增加；用它测定血浆中化学成分，结果可低5%左右。标本中如加入高浓度的草酸盐抗凝剂，可发生溶血和改变血液PH，干扰血浆中的钾、钠和氯测定，还能抑制有些酶的活性。3．肝素（heparin）肝素是生理性抗凝剂，广泛存在于肺、肝、脾等几乎所有组织和血管周围肥大细胞和嗜碱粒细胞的颗粒中。它是一种含硫酸基团的粘多糖，相对分子质量15000，带有较多负电荷。抗凝机制较为复杂，主要是加强抗凝血酶Ⅲ（antithrombinⅢ，AT-Ⅲ）灭活丝氨酸蛋白酶的作用，从而阻止凝血酶的形成，并有阻止血小板聚集等多种抗凝作用。每毫升血液抗凝需要肝素（15±2.5）IU，所用制剂多为肝素的钠盐或钾盐。肝素具有抗凝力强、不影响血细胞体积、不易溶血等优点。除有些因素会干扰凝血机制检查项目外，绝大多数的检查都可用肝素作为抗凝剂，它是红细胞渗透脆性试验理想的抗凝剂。尽管肝素可以保持红细胞的自然形态，但由于其常可引起白细胞聚集，并使血涂片在罗氏染色（Romanowsky’sstaining）时产生蓝色背景，因此肝素抗凝血不适合血液学一般检查。4．枸橼酸盐主要为枸橼酸三钠（trisodiumcitrate）,凝血试验时枸橼酸盐能与血液中的钙离子结合形成螯合物，从而阻止血液凝固。2Na3C6H5O7+2Ca2+→2CaC6H5O7-+6Na+枸橼酸钠与血液的比例为1；9。枸橼酸盐在血中的溶解度低，抗凝力不如前几种抗凝剂。多用于临床血液学检查，一般用于红细胞沉降率和凝血功能测定。因其毒性小，也是输血保养液的成分之一。第二节.血液涂片制备和细胞染色

血液涂片和染色的好坏直接关系到检验的结果，必须以认真负责的态度注意操作过程中的每一个环节。一.血液涂片制备血液涂片制备是血液学检查重要的基本技术之一。一张良好的血片，厚薄要适宜，头体尾要明显，细胞分布要均匀，血膜边缘要整齐，并留有一定的空隙。制备涂片时，血滴愈大，角度愈大，推片速度愈快则血膜愈厚，反之血涂片愈薄。血涂片太薄，50%的白细胞集中于边缘或尾部，血涂片过厚、细胞重叠缩小，均不利于白细胞分类计数。引起血涂片分布不均的主要原因有：推片边缘不整齐，用力不均匀，载片不清洁。二血液细胞染色

瑞氏染色法为了观察细胞内部结构，识别各种细胞及其异常变化，血涂片必须进行染色。血涂片的各种染色方法大多是罗氏染色法衍变而来，目前常用瑞士染色法（Wright’sstain）.1.瑞士染料是由酸性染料伊红（eosin,E-）和碱性染料亚甲蓝（methyleneblue,M+）组成的复合染料。亚甲蓝（又名美蓝）为四甲基硫堇染料，有对醌型和邻醌型两种结构。通常为氯盐，即氯化美蓝。美蓝容易氧化为一、二、三甲基硫堇等次级染料（即天青），市售美蓝中部分已被氧化为天青。伊红通常为钠盐。将适量的伊红、美蓝溶解在甲醇中，即为瑞氏染料。甲醇的作用：一是溶解美蓝和伊红ME，使其解离为M+和E-后两者可以选择性的吸附于血细胞内的不同成分而着色；二是具有很强的脱水作用，可固定细胞的形态，当细胞发生凝固时，蛋白质被沉淀为颗粒状或者网状结构，增加细胞结构的表面积，提高对染料的吸附作用，增强染色效果．2.染色原理是染料透入被染物并存留其内部的一种过程，此过程既有物理吸附作用又有化学的亲和作用，各种细胞成分化学性质不同，对各种染料的亲和力也不一样。因此，染色后，在同一血片上，可以看到不同的色彩，例如血红蛋白、嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结合，染粉红色，称为嗜酸性物质；细胞核蛋白和淋巴细胞质为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合，染紫蓝色或蓝色，称为嗜碱性物质；中性颗粒呈等电状态，与伊红和美蓝均可结合，染淡紫红色，称为中性物质。3.PH值的影响细胞各种成分均属蛋白质，由于蛋白质系两性电解质，所带电荷随溶液pH而定，在偏酸性环境中正电荷增多，易与伊红结合，染色偏红；在偏碱性环境中负电荷增多，易于美蓝或天青结合，染色偏蓝。因此细胞染色对氢离子浓度十分敏感。染色所用玻片必须清洁，无酸碱污染。配制瑞氏染液必须用优质甲醇，稀释染液必须用缓冲液，冲洗用水应近中性，否则可导致细胞染色反映呈色异常，影响形态识别，甚至造成错误。

新鲜配制的染料偏碱，须在室温或是37℃下贮存一定时间，待染料成熟，主要是让美蓝逐渐转变为天青B后才能使用，贮存时间愈久，染色效果愈好。Deam

Gilliand

等采用吸光度比值（ratioofabsorption,rA）作为瑞氏染液的质量规格。rA测定方法如下：取瑞氏染液15-25微升（视染液浓度而定）加甲醇10ml稀释，混匀后以甲醇为空白管，分别以波长650nm和252nm测吸光度（rA=A650/A525）。因为美蓝吸收峰波长为650nm，伊红吸收峰波长为525nm;天青B吸收峰也为650nm，但吸光度A约为美蓝的一半。所以，新配制的染料rA也相应下降。rA下降到1.3±0.1时即可使用。瑞氏染液贮存过程中，必须加塞，以防止甲醇挥发和被氧化成甲酸。有人主张在配方中加入甘油30ml，防止甲醇挥发，可使细胞染色清晰。甲醇必须纯净，如甲醇中丙酮含量过多，则染色偏酸，使白细胞着色不良。（二）吉姆萨染色法

吉姆萨染液由天青、伊红组成。吉姆萨染色原理和结果与瑞氏染色基本相同，但对细胞核和寄生虫（如疟原虫等）着色较好，结构显示更清晰，而胞质和中性颗粒则染色比较差。为兼顾两者所长，可用复合染色法，即在瑞氏染色过程中，以稀释的吉姆萨染液代替瑞氏染色缓冲液，或先用瑞氏染色法染色后，再用稀释吉姆萨染液复染。[方法学评价]血涂片的显微镜检查是血液细胞学检查的基本方法，良好的血片和染色是血液形态学检查的前提。１.血涂片的制备手工推片法用血量少、操作简单，是应用最广泛的方法。抗凝的血液病标本离心后取其灰白层涂片，可提高检出阳性率；但某些抗凝剂可使细胞形态发生变化，分类时应注意鉴别。此外，还可根据不同需要（如疟原虫、微丝蚴检查等）采用厚涂片法，旋转器涂片法，可获得细胞分布均匀、形态完好的血片，但尚未普遍推广。２.血液细胞染色瑞氏染色法是血细胞分析最经典和常用的染色法，尤其对于细胞质成分及中性颗粒等的染色，可获得很好的染色效果，但对细胞核的染色不如吉姆萨染液。故采用瑞氏--吉姆萨复合染液可取长补短，使血细胞的胞质、颗粒、胞核等均获得满意的染色效果。１.血涂片的制备手工推片法用血量少、操作简单，是应用最广泛的方法。抗凝的血液病标本离心后取其灰白层涂片，可提高检出阳性率；但某些抗凝剂可使细胞形态发生变化，分类时应注意鉴别。此外，还可根据不同需要（如疟原虫、微丝蚴检查等）采用厚涂片法，旋转器涂片法，可获得细胞分布均匀、形态完好的血片，但尚未普遍推广。２.血液细胞染色瑞氏染色法是血细胞分析最经典和常用的染色法，尤其对于细胞质成分及中性颗粒等的染色，可获得很好的染色效果，但对细胞核的染色不如吉姆萨染液。故采用瑞氏--吉姆萨复合染液可取长补短，使血细胞的胞质、颗粒、胞核等均获得满意的染色效果。第二章、血液一般检验

血液是血细胞和血浆组成的红色粘稠混悬液。血细胞包括红细胞、白细胞和血小板。血浆是复杂的胶体溶液，组分非常恒定。血浆中水分占91%-92%；固体成分占8%-9%，包括各种蛋白（抗体、酶、凝血因子等生物活性物质）、无机盐、激素、维生素和代谢产物。正常成人血量占体重的7%-9%，即60-80ml/kg体重。成人平均血量5l左右，其中血浆占55%，血细胞45%。血液的pH值为7.35-7.45，比密为1.050-1.060，相对粘度为4-5，血浆渗透压为290-310mOsm/kgH2O，血液离体后数分钟内即自行凝固。血液通过循环系统与全身各组织器官密切联系，参与机体呼吸、运输、防御、调节体液渗透压和酸碱平衡等各项生理活动，维持机体正常新陈代谢和内外环境的平衡。在病理情况下，造血系统的各种疾患，除直接累及血液外，常会影响全身组织器官，例如贫血患者，由于血液携带氧功能减低，可使全身各脏器缺氧，导致循环、消化、神经、呼吸、泌尿等系统出现相应的临床症状和体征；反之各组织器官的病变也可直接或间接地引起血液发生相应的变化，例如全身各组织的感染性炎症可引起血液内白细胞总数和分类计数的改变。因此，血液检验不仅是诊断各种血液病的主要依据，对其他系统疾病的诊断和鉴别也可提供许多信息，是临床医学检验中最常用、最重要的基本内容。第一节：

红细胞检查

红细胞（redbloodcell;erythrocyte）是血液中数量最多的有形成分。红细胞起源于骨髓造血干细胞（hematopoieticstemcell）,在红细胞生成素（erythropoietin,Epo）作用下经红系祖细胞阶段，分化为原红细胞，经过数次有丝分裂依次发育为早幼、中幼和晚幼红细胞。晚幼红细胞已丧失分裂能力，它通过脱核而成为网织红细胞。这一增殖、分化、成熟的过程在骨髓中进行约需72h。网织红细胞再经约48h即完全成熟。红细胞释放入血后，平均寿命约120d，衰老红细胞主要在脾破坏，分解为铁、珠蛋白和胆红素。红细胞逐渐衰老过程中细胞内酶的活性降低，红细胞膜生理功能所需要的能量供应减少，影响红细胞膜的功能；红细胞膜中的脂质成分也发生变化，这些都可使红细胞膜的变形性降低（正常红细胞变形性很强，能通过直径比它小得多的毛细血管），膜的脆性增加，这样的红细胞就容易被脾脏“阻滞”、破坏和吞噬细胞所吞噬；另一方面，衰老红细胞膜的表面所带的负电荷减少，使红细胞与红细胞之间的排斥效应降低，红细胞易于聚集，使体积增大，亦容易被脾脏“阻滞”而破坏。红细胞膜的正常功能主要有红细胞的变形性能、调节红细胞内离子平衡和维持细胞容积、稳定Ca2+的内环境等。...红细胞的主要生理功能是通过胞内的血红蛋白来实现的。红细胞有交换和携带气体的功能。红细胞经过肺部时，肺泡中的氧经过肺泡壁和毛细血管壁进入红细胞内，与红细胞内血红蛋白结合，随血液被带到各组织，此时血红蛋白在一定的环境条件下与氧气分离，氧气进入组织内供其利用；同时组织代谢后所产生的二氧化碳与血红蛋白结合经血流带到肺部，经肺泡排除体外，红细胞再携带氧向组织输送，如此往复，使全身组织能及时、充分地得到代谢所需要的氧和排出体内多余的二氧化碳。多种原因可造成红细胞生成和破坏的平衡失调，结果一方面使红细胞数量减少或增多，从而引起贫血或红细胞增多症，另一方面使红细胞在质量上发生改变。通过对红细胞和血红蛋白量的检查，以及对红细胞形态学或生化改变的检查，对诊断和鉴别某些疾病具有重要临床意义。一红细胞计数

红细胞计数（redbloodcellcount,RBC）是常用的血液基本检查项目。

[检测原理]

１.手工显微镜法用等渗稀释液将血液稀释一定倍数，充入血细胞计数池，在显微镜下计数一定体积内的红细胞，经换算求出每升血液中红细胞数量。２.血液分析仪法利用电阻抗和（或）光散射原理。[方法学评价]

１.手工显微镜法是传统的红细胞计数法，不需要特殊设备，但操作复杂、费时，现虽已不常用，但仍作为：①血液分析仪的校正。②与白细胞减少或血小板严重减少时的对照核实。③血小板计数受小红细胞干扰时的校正。２.血液分析仪法仪器法已成为目前细胞计数的主要方法，通常采用电阻抗原理。仪器法比手工显微镜法更精确，且操作简便、快速，已广泛应用。电阻抗计数法的变异系数（coefficientofvariation,CV）为2%，而手工法大于11%。在正常情况下，红细胞和白细胞的数量相差悬殊，白细胞的数量对红细胞计数影响较小；但当某些疾病时，白细胞数量明显增多，红细胞计数和体积测定结果均会受到干扰而产生误差。[质量控制]

1.手工法经过采血、稀释、充池、计数的环节，误差来源包括；⑴标本：血液如发生凝固可使细胞减少或计数不均，故应充分混匀血液和抗凝剂，且在充液前再次充分混匀。⑵操作：稀释、充池、计数等应严格按照规范操作。⑶器材：应使用标准的微量吸管、计数板。⑷固有误差（计数域误差）：利用下列公式可求出细胞计数95%的可信限及变异系数。细胞计数标准差：s=。。。。。12页细胞计数的变异系数：。。。1295%的可信限=计数值+2Sn：表示计数区域内所有细胞的总和计数值：采用国际单位制2.仪器法使用仪器严格按照操作规程；定期进行室内和室间质控。[参考值]成年：男性（4-5.5）×1012/L;女性（3.5-5.0）×1012/L；新生儿（6.0-7.0）×1012/L。临床意义]

[生理性变化１.年龄与性别的差异：初生儿，由于出生前以弥散方式从母体血液中获得氧气。通常处于生理性缺氧状态，故红细胞明显增高，但在出生2周后就逐渐下降。小儿生长发育时铁供应相对不足亦可引起贫血。男性儿童在6—7岁时最低，随着年龄增大而逐渐上升，到25—30岁时达高峰，30岁后随着年龄增加而逐渐下降，直到60岁时尚未停止。在女性儿童也随年龄增大逐渐增高，到13—15岁时达最高值，而后受到月经、内分泌等因素影响逐渐下降，到21—35岁维持最低水平后有逐渐增高与男性水平相近。男女两性的红细胞计数在15—40岁期间差别明显，主要可能与在此期间，男性雄性激素水平较高，而睾酮有促进红细胞造血作用有关。２.精神因素：感情冲动、兴奋、恐惧、冷水刺激均可使肾上腺素增多，导致红细胞暂时增多。３.剧烈体力运动和劳动：主要由于氧需要量增加，引起相对缺氧。一般成人在安静时全身每分钟消耗0.3-0.4L，肌肉运动时可增加到2—2.5L，最高可达到4—4.5L，此时由于红细胞生成素生成增加而骨髓加速释放红细胞，导致红细胞增多。４.气压降低：因缺氧刺激，红细胞可代偿性增生。高山地区居民和登山运动员红细胞数均高于正常，此因大气稀薄、氧分压低，机体红细胞生成素水平增高，引起骨髓产生更多的红细胞所致。５.妊娠中、后期：为适应胎盘循环的需要，通过神经、体液的调节，孕妇的血浆容量明显增加而引起血液稀释；6个月—2岁的婴幼儿由于生长发育迅速所致的造血原料相对不足；某些老年人造血功能明显减退，均可导致红细胞减少。红细胞计数值正常变异：新生儿较成人约增加35%，高海拔约增加14%。饮酒约减少5%，长期剧烈运动约减少15%，妊娠约减少16%，2个月婴儿约减少30%。病理性变化

红细胞和血红蛋白量减少：在临床最常见于各种原因的贫血。由于各种病因导致外周血单位体积红细胞减少，即为病理性贫血。贫血的诊断并不难，通过红细胞计数、血红蛋白测定或血细胞比容测定就可确定有无贫血和贫血的程度；贫血的原因诊断较为困难，一般应结合临床和进一步的检查进行诊断。按病因，可将贫血分成红细胞生成障碍、过度破坏和丢失（失血）3大类。１.急性、慢性红细胞丢失过多：如各种原因的出血，见于消化性溃疡、痔疮、十二指肠钩虫病等。２.红细胞寿命缩短：如各种原因的溶血，见于输血不合溶血反应、蚕豆病、遗传性球形细胞增多症等。３.造血原料不足：如慢性失血者对铁的重新利用率减少，铁供应或吸收不足。铁是制造血红蛋白的原料，原料不足使血红蛋白合成量减少，也有铁供应并不减少，而是由于先天性的或后天获得性的某种原因引起红细胞内酶的缺陷，而导致铁不能被利用合成血红蛋白，铁堆积在细胞内外，使发育中的细胞功能受障碍，红细胞过早死亡而致贫血；红细胞小、中心苍白区扩大等，但其血清铁和贮存铁却增加；在幼稚红细胞的周围围绕着铁颗粒，此为铁粒幼细胞贫血，有时可见于60岁以上的老年人，其原因不明。造血原料不足引起的贫血也见于某些药物如异烟肼、硫唑嘌呤、酒精、铅中毒，继发于某些疾病如类风湿性关节炎、白血病、甲状腺功能亢进、慢性肾功能不全等。４.骨髓造血功能减退：药物如抗肿瘤药物、磺胺类药物、保泰松、有机砷、马利兰等，可抑制骨髓的造血功能；物理因素如X线60钴、镭等核素照射均可抑制骨髓。造血功能障碍亦可继发于其他疾病，如慢性肾功能衰竭时，因有尿素、肌酐、胍类、酚、吲哚等物质潴留可对骨髓和红细胞有不良影响；原发性再生障碍性贫血是一种原因尚未完全了解的造血功能障碍，常有全血细胞减少。（2）红细胞增多

１）.原发性红细胞增多：见于真性红细胞增多症、良性家族性红细胞增多症等。真性红细胞增多症是一种原因不名的以红系细胞异常增殖为主的疾病，红细胞计数在（7-10）×1012/L，由于同时有中性粒细胞和血小板数目增多，故目前认为本病为多能干细胞受累所致；常见于40—70岁年龄组；典型患者，不但周围血液红细胞明显增多，且白细胞和血小板增高，有时伴慢性粒细胞性白血病。２.继发性红细胞增多症：常见于可以引起低氧血症的疾病：如1.心血管病：各种先天性心血管疾病如房室间隔缺损、法洛四联症。2.肺疾病：肺气肿、肺源性心脏病、肺纤维化和各种引起肺气体交换面积减少的病因。3.异常血红蛋白病：血红蛋白由于携氧能力降低而造成缺氧，使红细胞生成增多。4.肾上腺皮质功能亢进（库欣病），可能与皮质激素刺激骨髓使红细胞生成偏高有关。此外，引起红细胞数增高的药物有肾上腺素、糖皮质激素、雄激素等。３.相对性红细胞增多：由于血液水分的丢失，如呕吐、严重腹泻、多汗、多尿、大面积烧伤、晚期消化道肿瘤而长期不能进食等原因引起的血液浓缩，血液中有形成分相对增多，而并非是红细胞生成真性增加，多为暂时性增多。红细胞计数医学决定水平：

1.高于6.8×1012/L，应采取相应的治疗措施。2.低于3.5×1012/L为诊断贫血的界限，应继续寻找原因。3.低于1.5×1012/L应考虑输血。二、血红蛋白测定

血红蛋白是一种微红色的胶体物质，其相对分子质量为64458。它是一种呼吸载体，每克血红蛋白可携带氧1.34mL。成人红细胞总量约有600g血红蛋白，可携氧800mL。研究发现，红细胞内充满小颗粒，最小的直径为6.5nm，相当于1个血红蛋白分子的直径，此种颗粒于近红细胞膜处最多，越往细胞中央越少。这一分布与瑞氏染色血片上红细胞的着色特点，即周边深、中央浅所谓生理性中心淡染现象是完全一致的。（１）血红蛋白分子结构及成分

血红蛋白是在人体有核红细胞及网织红细胞内形成的一种含色素辅基的结合蛋白质。色素部分是亚铁血红素，蛋白质部分是由原卟啉和铁原子组成的一种结合物，合成受δ-氨基-γ酮戊酸合成酶、血红素本身和Fe2+调节。Fe2+位于卟啉环的中心，有6个配位键，其中4个与原卟啉分子中心的4个氮原子相联，第5个配位键与珠蛋白的肽连F段第8个氨基酸-组氨酸的咪唑基相连，第6个配位为空位，能可逆性地与氧结合，完成运氧功能。组成Hb的多肽链分为α和β两大类：1.α类连：α，ζ和θ链；2.非α链：、β、γ、δ、ε链。α链由141个氨基酸组成，β链由146个氨基酸组成。每个Hb分子由2条α类肽链和2条β类肽链组成，每条珠蛋白肽链含有1个亚铁血红素。在正常状态，机体有99%Hb的铁原子呈Fe2+状态，称为还原Hb，1%的Fe3+为高铁血红蛋白，只有亚铁血红蛋白，只有亚铁状态的Hb的铁原子才能与氧结合，此时称氧合血红蛋白。（二）血红蛋白的合成

血红蛋白的合成受激素的调节。影响Hb合成的激素有2种：一种是红细胞生成素，可促进δ-氨基-γ酮戊酸的生成与铁的利用，从而促进血红素和Hb的合成；二是雄激素，睾酮在肝脏内由5-β氢睾酮还原酶转变为5-β氢睾酮，它能促进δ-氨基-γ酮戊酸合成酶的生成。雄激素还能促进红细胞生成素的生成，直接和间接促进Hb的合成。当血红素合成过多时，血红素自发氧化为高铁血红素，高铁血红素对δ-氨基-γ酮戊酸合成酶有直接抑制作用，并能阻止δ-氨基-γ酮戊酸合成酶生成，进而减少血红素的合成。

在人体不同生长时期，Hb种类与比例不同。在胚胎发育早期，大约于妊娠第5周，ζ与ε基因即表达于卵黄囊的成红细胞中，形成了个体发育中第一个有功能的胚胎期血红蛋白四聚体ζ2ε2，在妊娠第6周，成红细胞开始由卵黄囊游移到肝脏，此时ζ表达水平显著降低，α和γ基因开始表达，由这些肽链组成3种胚胎期血红蛋白，HbGowerI ,HbGowerII,HbPortland和一种胎儿血红蛋白HbF，到胚胎发育第8周，ζ和ε链逐渐消失，γ链合成达到高峰，而且开始有β链合成，即有成人血红蛋白HbA产生。36周后β链合成迅速增加，γ链合成速率降低，出生后不久β和γ链合成大致等量，出生后3个月由于β链合成继续增加，而γ链合成迅速降低而使HbA占绝对优势，逐步占95%以上。而HbF逐步下降到小于或等于1%。δ链开始合成的确切时间不很清楚，由于脐带血中存在微量的δ链，说明它在胎儿时期已经开始合成，出生后γα2δ2占Hb总量的2%--3%。在人体不同生长期，Hb种类与比例不同。在胚胎发育早期，大约于妊娠第5周，ζ与ε基因即表达于卵黄囊的成红细胞中，形成了个体发育中第一个有功能的胚胎期血红蛋白四聚体ζ2ε2在妊娠第6周，成红细胞开始由卵黄囊游移到肝脏，此时ζ表达水平显著降低，α和γ基因开始表达，由这些肽链组成3中胚胎期血红蛋白，Hb

GowerI ,Hb

GowerII,HbPortland和一种胎儿血红蛋白HbF，到胚胎发育第8周，ζ和ε链逐渐消失，γ链合成达到高峰，而且开始有β链合成，即有成人血红蛋白HbA产生。36周后β链合成迅速增加，γ链合成速率降低，出生后不久β和γ链合成大致等量，出生后3个月由于β链合成继续增加，而γ链合成迅速降低而使HbA占绝对优势，逐步占95%以上。而HbF逐步下降到小于或等于1%。δ链开始合成的确切时间不很清楚，由于脐带血中存在微量的δ链，说明它在胎儿时期已经开始合成，出生后γα2δ2占Hb总量的2%--3%。（三）血红蛋白的代谢

正常人体内的红细胞不断地衰老、破坏更新，血红蛋白分子降解为珠蛋白和血红素。血红素中大部分铁由单核-吞噬细胞系统细胞加工处理后，再重新回到循环血液中，与运铁蛋白结合进入铁代谢库。珠蛋白由一系列蛋白酶和肽酶作用分解为氨基酸组分（内源性氨基酸），与外源性氨基酸混在一起，进入氨基酸代谢，可再与合成蛋白质和多肽或转变成其他含氮物质。[检测原理]

血红蛋白是一种色素蛋白，可以用比色法测定。血液中血红蛋白以各种形式存在，包括氧合血红蛋白、碳氧血红蛋白、高铁血红蛋白或其他衍生物。1.氰化高铁血红蛋白测定法(HiCN)血液中，除了硫化血红蛋白外各种血红蛋白均可被高铁氰化钾氧化为高铁血红蛋白，再和CN-结合生成稳定的棕色复合物氰化高铁血红蛋白。氰化高铁血红蛋白在540nm处有一吸收波峰，用分光光度计测定该处的吸光度，再换算成每升血液中的血红蛋白浓度，或制备标准曲线供查阅。2.其他测定法有叠氮高铁血红蛋白法、碱羟血红蛋白法、沙利酸化血红蛋白法等。[方法学评价]

自从1875年Gower设计了稀释溶血液目测比色法以来，Hb测定方法大致分为4大类：1.根据Hb分子组成测定总Hb法（全血铁法）；2.根据血液物理特性测定Hb（比重法、折射仪法）；3.根据Hb与O2可逆性结合的物性测定Hb（血气分析仪法）4.根据Hb衍生物光谱特点定量测定Hb。其中沙利法简单易行，得到长期广泛应用，但重复性差已被淘汰。为了统一Hb测定方法，1966年，国际血液学标准化委员会推荐氰化高铁血红蛋白测定法作为Hb测定国际标准参考方法。

氰化高铁血红蛋白测定法操作简单、显色快且结果稳定可靠，可检测除硫化血红蛋白（SHB）外的各种血红蛋白，但使用氰化高铁血红蛋白测定法时应强调仪器、比色杯、试剂及操作的标准化。仪器的校正是测定的关键。在实际工作中，使用的分光光度计很难达到上述要求，往往采用氰化高铁血红蛋白参考液，通过绘制标准曲线求出K值来校正结果，故定期地检查K值十分重要，氰化高铁血红蛋白测定法已在国内普及，但并非理想的方法，其致命的弱点是试剂氰化钾（KCN）有剧毒，使用、管理不当可造成公害，此外，还存在高白细胞和高球蛋白血症可致试剂混浊，以及HbCO转化较慢等问题。

实际工作中，多采用替代HiCN法的方法进行Hb测定，再将其结果校正到HiCN法水平。国内，多采用十二烷基硫酸钠（SDS）血红蛋白测定法，其原理是，除SHB外，血液中各种Hb均可与低浓度SDS作用，生成SDS-Hb棕红色化合物。其吸收曲线波峰在538nm,波谷在500nm，肩峰在560nm。由于摩尔消光系数尚未最后确认，因此不能用吸光度A直接计算Hb浓度。SDS可用HiCN法定值的抗凝血或溶血液，制备标准工作曲线，间接计算血红蛋白浓度。本法的优点是操作简单，呈色稳定，准确性和精确性符合要求，且无公害。在全国临床检验方法学学术会议上，被推荐为次选方法。SDS本身质量差异较大，且破坏白细胞，不适于同时用于有白细胞计数和Hb测定的血细胞分析仪上使用。

叠氮高铁血红蛋白（HiN3）测定法具有与HiCN测定法相似的优点，最大吸收峰在542nm，且峰值高度几乎与HiCN者重合。测定时显色快而稳定，试剂毒性仅为HiCN者的1/7，但仍存在公害问题。

Zander（1984）年提出碱羟血红蛋白（AHD575）测定法，575nm为其检出波长。该法试剂简单，不含有毒剂，呈色稳定，可用氯化血红素作标准品，已被许多单位采用。但由于血液分析仪或血红蛋白测定仪多采用540nm左右范围滤光板，限制了此法在该类仪器的使用。沙利法为传统的血红蛋白测定法，虽然操作简单但误差比较大，已经被列为县以上医院淘汰的实验项目。

近年来，多参数血细胞分析仪的应用，使Hb测定逐步以仪器法取代手工法，其优点是操作简单、快速，同时可以获得多项红细胞的参数，血液分析仪法测定血红蛋白的原理与手工法原理相似，多采用HiCN法，但由于各型号仪器使用的溶血剂不同，形成Hb的衍生物不同。某些溶血剂形成的衍生物稳定性比较差，因此要严格控制溶血剂加入量以及溶血时间，特别是半自动血细胞分析仪应严格控制实验条件。有些溶血剂内虽加入了KCN，但其衍生物并非是HiNC，仪器要经过HiNC标准液校正后，才能进行Hb测定。仪器法测定血红蛋白精确度CV约为1%。[质量控制］１.血标本异常血浆蛋白质、高脂血症、白细胞数超过30×109/L，脂滴等均可产生浊度，干扰Hb测定。２.方法

HiNC是Hb测定的首选方法；采用血液分析仪可减少手工法诸多误差。３.器材应选用高精度的微量吸管、配套的比色杯；分光光度计需要定期校正。４.采血部位由于不同的采血部位取样，其结果也有不同，静脉血比毛细血管血的结果低10%--15%。５.结果分析引起测定值高低的常见误差是稀释倍数不准确，或因红细胞溶解不当引起标本浊度增加，或血浆中脂质或蛋白量增加。[参考值]

成年：男性120-160g/L;女性：110-150g/L；2.新生儿：170-200g/L；3.老年：（70岁以上）：男性：94-122g/L；女性87-112g/L。

[临床意义]

年龄随着年龄增长血红蛋白可以有增高或降低，这种生理变化和红细胞相似。时间红细胞和血红蛋白量在一天中的时间内也存在着波动。据报道，上午7时出现高峰，随后下降，这一生理现象机智尚未阐明。.临床应用血红蛋白测定的临床意义和红细胞计数相似，但对贫血程度的判断上优于红细胞计数。需要注意的是：1.在某些病理情况下，血红蛋白和红细胞的浓度不一定能正确反映全身红细胞总容量的多少。大量失血时，在补充液体之前，循环血液最重要的变化是血容量的缩小，但此时血浓度很少变化，以致从血红蛋白浓度等数值来看，很难反映出贫血的存在，当体内发生水潴留时，血浆容量增大，此时即使红细胞容量是正常的，但血液浓度已经相对降低，因此从表面看来，存在贫血；相反，失水时，血浆容量缩小，血液浓度偏高，红细胞容量即使减少、但根据血红蛋白浓度等测定值，贫血仍可不明显。2.发生大细胞贫血或小细胞低色素贫血时，红细胞计数与血红蛋白浓度不成比例。大细胞性贫血的血红蛋白浓度相对偏高，小细胞低色素贫血的血红蛋白虽然低于正常，而红细胞计数也可正常。三、红细胞形态检查

各种病因可作用于红细胞生理进程的不同阶段，从而引起红细胞的病理变化，导致某些类型贫血的红细胞产生特殊的形态变化。此种形态学改变包括红细胞大小、形态、染色和内涵物的异常。红细胞形态检查与血红蛋白测定、红细胞计数结果相结合可粗略地推断贫血原因，对贫血的诊断和鉴别诊断有很重要的临床价值。[检测原理]将细胞分布均匀的血涂片，进行染色（如瑞氏染色），由于不同的细胞及其不同成分对酸性及碱性染料的结合的多少不同，从而使各种细胞呈现出各自的染色特点。一般由人工在显微镜下进行识别。[方法学评价]近年来，血细胞分析仪广泛用于全血细胞计数，而观察血涂片可用于估计相应血细胞数量，因而显微镜细胞数量和形态的观察现常作为对仪器分析质控的参考对照，但如果血片制作不良和染色不佳，常使细胞鉴别发生困难，甚至导致错误结论。[质量控制]1.选择细胞分布均匀的区域：在整张血涂片上红细胞通常不是均匀分布的，一般理想的红细胞形态应在红细胞紧密排列但不重叠的区域。要从血涂片对异常红细胞定量比较困难。红细胞分布太少或太多都会受人为影响。有时在血涂片可见红细胞堆积在一起呈穿线状，往往是由于正常血液标本中红细胞过于密集造成的，但如果在血涂片比较薄的区域出现此现象，则可能是红细胞外附有过量球蛋白，使红细胞间正常的电荷排斥减少而引起凝集。2.注意完整的检查顺序：检查血涂片，应先在低倍镜下估计细胞的分布和染色情况，再用油镜观察血膜体尾交界处的细胞形态。同时浏览是否存在其他异常细胞如幼稚或有核红细胞等。浏览全片尤其重要，因异常成分集中在血片的边缘，容易漏检；应按规范步骤，系统地分析血涂片上的各类细胞。[参考值]瑞氏染色血涂片成熟红细胞形态：双凹圆盘形，细胞大小相似，平均直径7.2um（直径范围6-9.5um）；淡粉红色，中央1/3为生理性淡染区；胞质内无异常结构。临床意义红细胞形态变化主要包括以下4个方面：1、红细胞大小不一在分析贫血原因时，术语小红细胞和大红细胞等描述细胞大小，其实际含义是指细胞体积而不只是指直径大小，故可从血片直接感知直径而推知细胞及血红蛋白的容积。（1）小红细胞：指直径小于6UM的红细胞。正常人偶见。血涂片中出现较多染色过浅的小红细胞，提示HB合成障碍，见于缺铁性贫血、珠蛋白生成障碍性贫血。而遗传性球性细胞增多症的小红细胞，其HB充盈良好，生理性中心浅染区却消失。（2）大红细胞：指直径大于10μm的红细胞。为未完全成熟的红细胞，体积较大，因残留脱氧核糖核酸，经瑞氏染色后而呈嗜多色或含有嗜碱性点彩。常鉴于巨幼细胞性贫血，也可见于溶血性贫血、恶性贫血等。（3）巨红细胞：指直径大于15μm的红细胞。最常见于叶酸及VitB12缺乏所致的巨幼细胞性贫血。由于缺乏上述因子，幼稚红细胞内DNA合成不足，不能按时分裂，当这种幼稚红细胞脱核之后，便成巨大的成熟红细胞。血涂片如同时存在分叶过多的中性粒细胞则更有助于诊断。（4）红细胞大小不均：是指同一患者的红细胞之间直径相差一倍以上而言。大者红细胞直径可达12μm，小者直径仅2.5μm。常见于严重的增生性贫血，巨幼细胞性贫血时尤为明显，可能与骨髓粗制滥造红细胞有关。2.红细胞内血红蛋白含量改变（1）正常色素性：红细胞着色的深浅取决于血红蛋白含量的多少，含量多者着色深，含量少者着色淡。正常红细胞在瑞氏染色的血片中为淡红色圆盘状，中央有生理性淡染区，通常称正常色素性。除见于正常人外，还见于急性失血、再生障碍性贫血和白血病等。（2）低色素性：红细胞的生理性中心浅染区扩大，甚至有的红细胞仅于其周边着色，中央不着色，成为环形红细胞，提示其血红蛋白含量明显减少。常见于缺铁性贫血、珠蛋白生成障碍性贫血、某些血红蛋白病。（3）高色素性：红细胞中心淡染区消失，细胞着色比较深，整个红细胞均染成红色，而且胞体也大。其平均红细胞血红蛋白的含量增高，而平均血红蛋白浓度多正常。最常见于巨幼细胞性贫血。（4）多色性：它是刚脱核而尚未完全成熟的红细胞，故其细胞体积较大。由于胞质内尚存有少量嗜碱性物质（RNA），因而红细胞被染成灰红色或淡灰蓝色。正常人外周血中此种细胞占1%左右。多色性红细胞增多提示骨髓造红细胞功能活跃。尤见于溶血性或急性失血性贫血。（５）细胞着色不一：指同一血涂片中，同时出现低色素性和正常色素性两种形态细胞，有时又称双形性贫血，多见于铁粒幼红细胞性贫血。

3.红细胞形状改变

（1）球形细胞：该细胞在血液中为球形，而在涂片上则显示细胞中心着色比较深，体积比较小，有球形之立体感。其主要变化为细胞厚径加大，使细胞的直径与厚度之比减少至2.4：1或更小。球形红细胞的气体交换功能较正常红细胞为弱，且容易招致破坏和溶解。主要见于遗传和获得性球形细胞增多症（如自身免疫溶血性贫血或直接理化损伤如烧伤等),偶尔见于小儿,但无临床意义。(2)椭圆形细胞(elliptocyte):

红细胞呈椭圆形、杆形,两端钝圆,长轴增大,短轴缩短。长度可大于宽度3~4倍,最大直径可达12.5um,横径可为2.5um。这种红细胞生存时间一般正常,有时可缩短,但血红蛋白并无异常。其形成机制可能与遗传所致的细胞膜异常基因有关,因为细胞只有成熟后才会呈现椭圆形,且将此种红细胞置于高渗、等渗、低渗溶液或正常人血清内,其椭圆形保持不变,而幼红细胞,即使是网织红细胞,均不呈椭圆形。见于遗传性椭圆形细胞增多症(可达25%至高达75%)、大细胞性贫血(可达25%偶见于缺铁性贫血、骨髓纤维化、巨幼细胞贫血、镰形细胞性贫血。正常人血液中约占1%,但不超过15%。(3)靶形细胞(targetcell):红细胞中心部位染色较深,其外围为苍白区域,而细胞边缘又深染,形如射击之靶。有的中心深染区呈红细胞边缘延伸的半岛状或柄状而成为不典型的靶形细胞。靶形细胞直径可比正常红细胞大,但厚度变薄,因此体积可正常。近来研究证明,此种细胞的出现主要是由于红细胞内血红蛋白的化学成分发生变异,以及铁代谢异常所致。其形成过程是:红细胞中的血红蛋白首先溶解成二镰状或弓形空白区,其后弓形空白区的两端继续向内弯曲延伸,以至连接成一环形透明带。此种细胞的生存时间约仅为正常红细胞的一半或更短。常见于各种低色素性贫血,尤见于珠蛋白生成障碍性贫血、HbC病,也见于阻塞性黄疸、脾切除后状态。应注意与血涂片制作中未及时固定而引起的红细胞形态改变相区别。

（4）口形细胞(stomatocytΘ:红细胞中央有裂缝,中心苍白区呈扁平状,颇似张开的口形或鱼口。此种红细胞有膜异常,使Na+透过性增加,细胞膜变硬,因而脆性增加,致使细胞生存时间缩短。常见于口形红细胞增多症,小儿消化系统疾患引起的贫血,也可见于乙醇中毒、某些溶血性贫血及肝病患者等。正常人偶见((4%)。(5)镰形细胞(SIcklecell):红细胞外形呈镰刀状、线条状,或呈L、S、V形等。主要原因是含有的异常HBS的红细胞，在缺氧情况下溶解度降低,形成长形或尖形的结晶体,使细胞膜发生变形。因此,检查镰形细胞需将血液制成湿片,然后加入还原剂如偏亚硫酸钠后观察。普通血片中呈现的镰状红细胞可能是在脾:骨髓或其他脏器的毛细血管中因缺氧而致变形的红细胞。镰状细胞贫血(Hbs-S,HbS-O和镰状细胞特性(HbA-s)的血标本,在缺氧的条件下,可有大量镰状细胞。(6)棘形细胞(anthocyt):红细胞表面有针尖状突起,其间距不规则,突起的长度和宽度可不一。多见于遗传性或获得性β脂蛋白缺乏症,可高达70%—80%;也可见于脾切除后、酒精中毒性肝脏疾病、尿毒症。棘红细胞应与皱缩红细胞区别。皱缩红细胞,也称锯齿状红细胞(crenated

cell,echinocytΦ,可因制片不当、高渗等原因引起,红细胞周边呈锯齿形,排列紧密、大小相等,外端较尖。。(7)新月形红细胞(meniscocyte):红细胞残缺不全,体积大,状如新月形,直径约20um。此种红细胞着色极淡,必须仔细辨认,否则不易发现。在蒸馏水试验时出现此种细胞是由于红细胞内渗透压高,将水分吸人使细胞体积胀大,又在涂片时细胞被推破所致。见于某些溶血性贫血(如阵发性睡眠性血红蛋白尿症),其意义不明。正常人涂片上不见此种细胞。(8)泪滴形细胞(t∞rdropcell):成熟红细胞形如泪滴样或梨状。其形成机制尚无定论,可能是由于细胞内含有Heinz小体或包涵体所致;或是红细胞膜的某一点被粘连而拉长之故。质内含有-Heinz小体或包涵体所致。被拉长的细胞可长可短。多色性红细胞亦可有此形状者。多见于贫血、骨髓纤维化症时,偶见于正常人。、（9）缗钱状形成〈rouleauxformation〉当血浆中的慕些蛋白,尤其是纤维蛋白原和球蛋白增高时,可促使红细胞表面电荷发生改变,而使其互相连接如缗钱状,故而得名。(lO)裂红细胞(schistocyte):为红细胞碎片

或不完整的红细胞。大小不一,外形不规则,有各种形态如刺形(burD、盔形(helme0、三角形、扭转形等。此系红细胞通过因阻塞而致管腔狭小的微血管所致,见于弥散性血管内凝血、微血管病性溶血性贫血、重型珠蛋白生成障碍性贫血、巨幼细胞性贫血、严重烧伤。正常人血涂片中裂片细胞小于2%。(11)红细胞形态不整(poikilOcytosis)指红细胞形态发生各种明显改变的情况而言,出现不规则的奇异形状,如豆状、梨形、蝌蚪状、麦粒状和棍棒形等。此种细胞在某些感染或严重贫血时多见,最常见于巨幼细胞性贫血。异形红细胞产生的原因尚未明,有人认为是化学因素,尤其是磷脂酰胆碱、胆固醇和丙氨酸等对红细胞的形态有影响,亦有人认为是物理因素所致。(12)有核红细胞(nucleatederythrocyte)即血片中可见到少量有核红细胞,而成人有核红细胞均存在于骨髓之中,如见于外周血血涂片则为病理现象。病理情况有:1)溶血性贫血:最常见于严重的溶血性贫血、新生儿溶血性贫血、自身免疫性溶血性贫血、巨幼细胞性贫血。因红细胞大量破坏,机体相对缺氧,导致促红细胞生成素水平增高,骨髓红系增生,除了网织红细胞大量入血外,一些幼稚红细胞提前释放入血,此种现象说明骨髓有良好的调节功能。2)造血系统恶性疾患或骨髓转移性肿瘤:见于各种急、慢性白血病及红白血病。由于骨髓中大量白血病细胞充斥而排挤释放幼红细胞,也可因髓外造血缺乏控制能力所致,有核红细胞以中、晚幼红细胞为主。在红白血病时,则可见到更早阶段的红细胞,且伴有形态上有巨幼样变及其他畸变的有核红细胞。3)慢性骨髓增生性疾病:尤其是骨髓纤维化,周围血涂片可阶段性出现有核红细胞,作为涂片中最显著的变化,源于髓外造血和纤维化变化的骨髓。4)脾切除后:骨髓结构正常时,仅有个别的有核幼稚红细胞可能到达髓窦,并由此进人周围血液,通常立刻被脾脏扣留。脾切除后,无此约束,因此血涂片中常可见到少量有核红细胞。4.红细胞内出现异常结构

(1)嗜碱性点彩红细胞(抚sopMic吱ipoingcell):简称点彩红细胞,指在瑞氏染色条件下,成熟红细胞或幼红细胞的胞质内出现形态不一的蓝色点状物,即核糖核酸(ribonucleicacid,RNA),属于未完全成熟红细胞，其颗粒大小不一、多少不等。其可能的原因有2种:①重金属损伤细胞膜:使嗜碱性物质凝集。②嗜碱性物质变性,近来有人证明,此是血红蛋白合成过程中,原卟啉与亚铁结合受阻之故,其中以铅的作用最为明显,所以在铅中毒时,此种细胞明显增加,常作为铅中毒诊断筛选指标。在其他各类贫血中,亦可见到点彩红细胞,其增加常表示骨髓造血旺盛或有紊乱现象。正常人血涂片中很少见到嗜碱性点彩红细胞(1/10000)。(2)豪焦小体(Howell-Jolly’sbody):又称为染色质小体。成熟红细胞或幼红细胞的胞质内含有一个或多个直径为1~2um的暗紫红色圆形小体。已证实此小体为核碎裂或溶解后所剩残余部分。可见于脾切除术后、无脾症、脾萎缩、脾功能低下、红白血病和某些贫土患者:在巨幼细胞贫血时,更易见到。(3)卡波环(Cabotring):在嗜多色性或碱性点彩红细胞的胞质中出现的紫红色细线圈状结构,呈环形或8字形。其来源及性质未明。也有人认为是纺锤体的残余物质（电镜下可见此时形成纺锤体的微细管着色点异常）；现认为可能是胞质中脂蛋白变性所致，常与豪焦