动物寄生虫病常规实验室诊断技术

动物寄生虫病常规实验室诊断技术李永光;贾龙杰【摘要】动物寄生虫病危害严重，可导致动物生产性能下降，畜产品废弃甚至动物死亡严重影响了畜牧养殖业的发展和人类健康.大多数动物寄生虫病临床症状不明显仅表现为消瘦、贫血、生长发育受阻、生产性能降低等慢性消耗性疾病的症状，因此仅根据流行病学和临床症状较难做出诊断，而现代分子生物学诊断技术如PCR等由于实验条件和技术水平限制很难在基层兽医临床运用.本文结合基层兽医临床诊断现状，对常用的一些常规实验室诊断技术进行了归纳总结.旨在促进基层临床医生全面地认识动物寄生虫病，并进行有效的诊断、预防和治疗.【期刊名称】《畜牧兽医杂志》【年(卷)，期】2017(036)005【总页数】3页(P145-147)【关键词】动物寄生虫病;症状;实验室诊断技术;重要意义【作者】李永光;贾龙杰【作者单位】定西市临洮农业学校，甘肃定西730500;定西市临洮农业学校，甘肃定西730500【正文语种】中文【中图分类】S855.9动物寄生虫病多属于慢性消耗性疾病，临床症状不明显，不能引起人们的充分重视，导致动物生产性能下降，畜产品废弃甚至动物死亡，对畜牧业生产、肉食品加工和外贸出口造成了严重的经济损失。只有准确诊断出动物寄生虫病，阻断其传播和扩散，才能保障动物和人类的健康。兽医临床上，仅仅根据流行病学和临床症状很难对动物寄生虫病确诊，需要借助一些实验室诊断技术才能准确诊断出常见动物寄生虫病，目前临床上常用的实验室诊断方法有常规实验室诊断方法、免疫血清学诊断方法和分子生物学诊断技术。鉴于基层养殖场和农村地区的实验室条件相对落后，技术人员操作水平有限，对于运用分子生物学诊断技术诊断动物寄生虫病很难实现，另一方面，寄生虫病诊断试剂盒尚处于开发研究的初步阶段，在临床上应用较少，故本文重点论述当前基层兽医临床上广泛使用的动物寄生虫病的诊断方法。1.1粪便检查法粪便检查是动物肠道寄生虫病生前诊断的最基本、最常用的方法。检查到粪便中的虫卵、幼虫或成虫，可以确诊某种寄生虫病。常用粪便检查方法有涂片法、饱和食盐水漂浮法和沉淀法。粪便要尽量新鲜，干燥粪便易导致虫卵变形，对牛于马等大动物，可通过直肠检查法从直肠掏取，对于羊犬猫等中小动物，一般用食指钩取少量粪便。若采样粪便不能及时检查，可将其加入到50~60°C的福尔马林(5%~10%)溶液中，以保持虫卵的固有形态。1.1.1虫体和虫卵简易检查法(1)肉目艮观察：对动物排出的新鲜粪便，先用玻璃棒或者小木棒搅拌，观察是否含有某种寄生虫体或者是虫体节片，继而在所检粪便中加5~7倍体积清水进行充分混匀，沉淀后弃去上层浑浊液，再加入等量清水，反复清洗，直至上层清液清亮，最后用放大镜观察粪渣中是否含有虫体，临床主要用于消化道虫体的检测，如绦虫、线虫等。(2)直接涂片法：在洁净的载玻片上滴1~2滴清水或50%甘油水溶液，取黄豆粒大小的被检粪块与之混合，涂匀并剔除粗粪渣，盖上盖玻片，置于显微镜下检查。该法简便易行，适用于检查各种蠕虫的虫卵、球虫卵囊等，方法简便，但检出率较低，可以多制作几个涂片以提高检出率。1.1.2饱和食盐水漂浮法线虫卵、绦虫卵和球虫卵囊密度小于盐水密度，在盐水中向上漂浮，浮聚于盐水表面，取表膜液制片镜检，根据虫卵形态确诊。将食盐加入沸腾的水中，边加入边搅拌，直到不再溶解为止（1L水大约加400g食盐）；取5~10g粪便置于100mL小烧杯中，加入10~20倍的饱和食盐水，用玻璃棒搅拌溶解；用两层纱布过滤粪溶液，再用250um（60目）细网铜筛过滤，将滤液倒入5mL试管或青霉素小瓶内，用胶头滴管滴加滤液使液体面稍凸出于试管口或瓶口，加盖载玻片，静置30min左右，加盖玻片镜检。1.1.3沉淀法吸虫卵和棘头虫卵密度大于水，可自然沉于水底（使用离心沉淀法可以大大缩短沉淀的时间），收集洗干净的沉淀物制片镜检，根据虫卵形态确诊。取粪便5~10g置于烧杯中，加入少量水捣成泥状，再加入10~0倍水充分搅拌溶解；用金属网筛260~250?m（40~60目）或两层纱布过滤，滤液静置15~20min，倾去上层液，保留沉渣；再加水与沉淀物重新搅匀，静置，如此反复操作，直至上层液透明为止，最后倾去上清液，用滴管或吸管吸取沉淀物滴于载玻片上，加盖玻片后镜检。1.1.4粪便幼虫培养法圆线虫目所属线虫的虫卵在形态上非常相似，很难区别，临床上经常将含有虫卵的粪便加以培养，待其中虫卵发育成为幼虫时，再检查幼虫，根据幼虫形态上的差异，加以鉴别。在固定于漏斗架上的漏斗下端接一根10~15cm长的胶皮管，其下端用止水夹固定。取10-20g粪便放在漏斗里的金属网筛上，沿漏斗边缘缓缓加入40^左右的温水，直到把粪便淹没为止，静置0.5-3.0h,幼虫从粪便中游出，沉于底部；小心打开止水夹，使底部的液体流入离心管内，离心沉淀1min，吸去离心管内的上层液，把底部的沉淀物摇匀，用滴管移至载玻片上，或全部倒入小平皿内，用放大镜或在低倍显微镜下检查有无活动的幼虫。1.2皮肤刮取物检查法主要用于动物体表微小寄生虫的检测，如疥螨（0.2-0.5mm）、痒螨（0.5mm）左右。在脱毛皮肤和健康皮肤交界处刮取皮屑，这里的螨较多，刮取时先剪毛，取凸刃小刀，在酒精灯上消毒，用手握刀，使刀刃与皮肤表面垂直，刮取皮屑时，应刮到皮肤轻微出血，然后将皮屑置于黑色背景的培养皿内观察是否有虫体，或者将皮屑置于载玻片上，滴加50%甘油溶液一滴，制片镜检。为了在较多的病料中检出较少的虫体，可采用浓集法提高检出率。1.3肌肉压片镜检法主要用于旋毛虫的检测，在左右膈肌角分别剪取24粒肌肉粒，置于载玻片上，制作肌肉压片，低倍显微镜镜检观察在被检测的肌肉压片中是否含有肌旋毛虫包囊。1.4血液检查法用于伊氏锥虫、巴贝斯虫和泰勒虫等血液内寄生虫的检查。一般在病畜高温时采取耳静脉血液，做成血液涂片镜检，或直接鲜血压滴镜检，或血液离心后将虫体浓集制片镜检，发现某种寄生虫即可确诊。注意班氏丝虫和马来丝虫的微丝蝴在晚间出现在末梢血里，必需在深夜进行检查。1.5淋巴结穿刺检查法适用于泰勒虫病、弓形虫病的生前诊断。常规消毒局部皮肤和术者手臂，术者以左手食指和拇指固定淋巴结，右手持10mL干燥注射器将针头直接刺入肩前淋巴结或股前淋巴结内，深度依淋巴结大小而定，然后边拔针边用力抽吸，利用空针内的负压将淋巴结内的液体和细胞成分吸出，固定注射器内栓拔出针头后将注射器取下，充气后再将针头内的抽出液喷射到玻璃片上制成均匀涂片，染色镜检。1.6腹水检查法主要用于弓形虫病的生前诊断。常规消毒局部皮肤和术者手臂，穿刺腹腔取腹水，在载玻片上抹片，瑞氏染色后镜检观察是否含有滋养体。1.7尿液检查法常采用清晨尿液，沉淀后取沉淀检查，本方法着重于检查泌尿系统寄生虫虫体，由于泌尿系统寄生虫较少，因而此法较少用，中国南方主要用于检查猪肾虫。寄生虫本身及其分泌物、代谢产物等均可作为抗原刺激动物机体产生相应抗体，可以通过已知抗原或抗体，检测动物血清中相应抗体或者抗原的存在性，从而判断该动物是否患有这种寄生虫病。免疫血清学诊断方法是动物寄生虫病生前诊断的重要方法之一。2.1皮内实验宿主在寄生虫变应原刺激后，体内产生亲细胞性抗体(IgE和IgG4)，当其与相应抗原结合后，肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱颗粒，释放生物活性物质，引起注射抗原的局部皮肤出现皮丘及红疹，以此便可判断体内是否含有某种特异性抗体存在，该法操作简单，并且可现场观察结果，适宜现场应用，但假阳性率较高。皮内试验用于多种蠕虫病，如血吸虫病、肺吸虫病、姜片吸虫病、囊虫病、棘球蝴病等的辅助诊断，具体操作方法如下：按照1：3000的比例制备新鲜成虫匀浆，使用无菌注射器和皮试针头对待检动物进行皮试注射，注射剂量为0.1mL。注射后15min观察待检动物的注射部位是否出现丘疹，如果出现要测量其最大直径，最大直径大于或等于1.0cm的为阳性反应。2.2环卵沉淀实验抗原存在于虫卵内，以虫卵检测待测动物的血清内的特异性抗体，临床上常用于日本血吸虫和旋毛虫幼虫的检测。操作方法：抽取待检动物的血液样本进行离心处理获得血清，用融化的石蜡在干净的载玻片上划2道间距约为20mm的直线，待石蜡干燥后在2道线间滴加2滴待检动物的血清。然后再向血清中加入约100个干燥的虫卵混匀，覆上盖玻片并用石蜡密封四周。将玻片置于温箱中培育48h后在显微镜下观察结果。根据虫卵周围出现的沉淀物的大小进行阳性判断。2.3间接血凝试验应用公绵羊红细胞或乳胶颗粒等作为载体，与虫体抗原相结合使之致敏，再与患畜血清或其他体液中的抗体结合产生凝集现象，根据其凝集程度而判定阳性结果。操作方法：先在U型微量血凝板的第一排的第一孔、第二孔、第三孔和第四孔内分别滴加0.9%的氯化钠溶液，再向第一孔加入待检血清样本混匀，对第二、三、四孔依次根据递减稀释法进行滴加。在第三孔和第四孔内加入稀释后的致敏红细胞悬液，旋转震摇混匀后在室温下静置1h后观察记录结果。根据四个孔内的阳性反应情况判断是否为某种寄生虫病患者。该法操作简便，特异性和敏感性均较理想，适宜动物寄生虫病的辅助诊断和现场流行病学调查。主要用于诊断阿米巴病、弓形虫病、血吸虫病、囊虫病、旋毛虫病、肺吸虫病和肝片吸虫病等。2.4酶联免疫吸附试验(ELISA)将虫体抗原包被包被聚苯乙烯板，4°C冰箱内过夜培育，冲洗后加入患畜血清，使免疫反应在载体上进行，然后加入酶标记的第二抗体，作为免疫反应的指示剂，通过酶对底物的催化作用而产生有色产物，根据其光密度以定量测定抗体含量。此法可用于宿主体液、排泄物和分泌物内特异性抗体或抗原的检测，灵敏度较好，且能判断寄生虫病的感染强度，是目前诊断多种寄生虫病的常用方法。血清学诊断虽可用于动物寄生虫病的生前检测，但以ELISA为代表的免疫学诊断方法，其特异性较低，在临床上常常会出现交叉反应，而且受抗原、抗体水平变化的影响，多用作辅助诊断手段而非确诊。主要用于原虫病的诊断方面，且常在其他方法不能诊断时应用该法。用采自患病动物病料对最易感的实验动物进行人工接种，进行疾病的复制，待虫体在其体内大量繁殖后再对实验动物进行检查，如对伊氏锥虫病和弓形虫病的实验室诊断可采用此法。B型超声检查对各类囊虫病、包虫病和阿米巴肝脓肿等的诊断及定位具有重要意义。肝脏CT扫描对肝脏包虫病，头颅CT扫描或MRI对脑囊虫病、脑弓形虫病、脑包虫病等病的诊断及鉴别诊断具有重要价值。可分为全身性剖检、个别系统剖检及个别器官剖检等。尸体剖检可以查明动物所有器官组织中的寄生蠕虫，包括生前诊断法所不能查出的虫