大鼠模型行取术后造模速度和质量的提高

大鼠模型行取术后造模速度和质量的提高

在紧密相连的动脉中产生的大鼠心肌梗死模型（以下简称心梗）的变化与冠状动脉粥样硬化和心绞痛之间的变化相似，这是由冠状动脉粥样硬化和心绞痛引起的。在这种模式下，可以进行心电图、组织染色和血清酶学综合指标的测定。特别是，可以通过氯仿-四氮唑兰（n-bt）染色观察心梗区域内的非血管区域大小，来评估模型是否成功，以及药物是否有效。但是对于手术操作者,除需要掌握心脏的解剖结构以及冠状动脉的走向外,还要具备熟练的操作技能,并且也存在切口长、出血多、需开胸、创伤大等缺点,导致动物恢复较慢,容易造成动物死亡,即使初步掌握结扎技术提高了动物的存活率,还存在模型制作的过程较慢,完成1个完整的实验短则1周,长则以月计的特点,时间过长实验者和动物的状态可能会有一定的变化而影响到实验结果的稳定性。其次,在实际的操作过程中也存在模型制作方法不规范导致的模型质量不稳定。不稳定的原因是多方面的,其中麻醉剂的使用是主要因素之一,哪一种麻醉剂更适合使用,是一个重要问题,在药理实验方法学中推荐使用的是乌拉坦,但是在实际模型制作过程中有使用戊巴比妥钠作为麻醉剂的,有使用水合氯醛作为麻醉剂的,有使用氯胺酮作为麻醉剂的,还有使用其他麻醉剂的。如边素艳等报道水合氯醛存在诱导时间长、呼吸道分泌物较多、麻醉剂量与中毒量接近,且有心脏毒性的问题,而水合氯醛又是在模型制作过程中使用较多的麻醉剂。本课题组2002年以来在李连达院士的指导下,制作结扎冠状动脉在体大鼠心梗模型,制作初期发现用复合麻醉及经口气管插管法制作的模型可以提高初学者模型制作的成功率,此后,在熟练的基础上又发现通过摒弃呼吸机造模的方法可以在保证模型质量的情况下提高模型制作的速度。经过近10年的实践工作后,发现还可以通过结扎1次以及选用适合的麻醉剂来提高模型制作的速度和质量。本研究通过比较制作模型过程中的不同操作方法和使用戊巴比妥钠与水合氯醛两种麻醉剂对模型制作的影响,探讨提高模型制作速度和质量的方法。材料和方法1南京华文股份有限公司健康Wistar大鼠100只,雄性,体重200~220g,由北京华阜康科技股份有限公司提供。许可证编号:SCXK(京)2009-0007。2化学试剂:氯醛N-BT,批号:F20050421,国药集团化学试剂有限公司;水合氯醛,批号:T20050609,国药集团化学试剂有限公司;纷腾V7扫描仪,中晶科技;DT-2000型电子天平,美国双杰兄弟有限公司生产;MPIDS-500多媒体彩色病理图像分析系统,北京空海公司生产。3方法3.1大鼠板上大鼠以10mL/kg腹腔注射3.5%水合氯醛麻醉,仰卧固定于大鼠板上。在大鼠左侧第4、5肋间切口,打开胸腔,撕开心包,轻压胸廓挤出心脏,用0号手术线于左心耳下2mm处结扎冠状动脉左前降支,立即将心脏放回胸腔,关闭切口,缝合皮肤。3.2麻醉固定大鼠分别以10mL/kg腹腔注射3.5%水合氯醛和按1.5mL/kg腹腔注射3%的戊巴比妥钠麻醉,仰卧固定于大鼠板上。在大鼠左侧第4、5肋间切口,打开胸腔,撕开心包,轻压胸廓挤出心脏,用0号手术线于左心耳下2mm处结扎冠状动脉左前降支,立即将心脏放回胸腔,关闭切口,缝合皮肤。3.3小组3.4开腹时间、国际时间和存活率心梗面积:将心脏切成均匀5片,N-BT染色,扫描仪分别扫描5片心肌的正、反面,获得扫描图像,测量梗死区的面积;开胸时间:从心脏被挤出到结扎冠状动脉后放回胸腔的时间;结扎时间:从针扎过冠状动脉到结扎完成的时间;麻倒所需时间:从腹腔注射麻醉剂开始到大鼠自行倒下的时间;苏醒所需时间:从大鼠自行倒下到自行醒来的时间;造模后存活率(%)=造模后存活只数/每组动物只数×100%;心梗面积边界清晰率(%)=心梗面积边界清晰数/造模后存活只数×100%。3.5统计方法用SPSS11.5统计软件进行数据分析。数据以表示,组间比较采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。结果1不同的钻孔方法对急性心轴模型的心轴面积和生产速度的影响表12各种麻醉剂对急性心梗模型的麻醉时间和心茎表面的影响表23不同的麻醉剂对血管收缩率和心脏病变区面积限制的影响心梗模型的制作结扎冠状动脉制作在体大鼠心梗模型的心功能、心电图和代谢等多项指标均可出现显著变化,通过梗死范围及相关指标的检测可研究药物对心肌的保护作用。该模型被作为中药相关药效学评价标准的必要方法,但是该模型制作存在造模后动物存活率低、制作速度慢、模型质量不高等问题。此模型因其无可比拟的优势以及面临的诸多困难,多年来成为许多科研工作者研究的对象。解决结扎冠状动脉制作在体大鼠心梗模型存在的问题应分3个阶段,第一是提高存活率,第二是提高有效率,第三是保证制作的速度。在提高急性心梗大鼠模型存活率和有效率方面很多学者做了大量有效地探索。向平等发现高位结扎加用利多卡因的方法可以提高大鼠的存活率和有效率。边素艳等发现可以通过实验动物选择、麻醉剂选择、人工呼吸管理、冠脉结扎方法等综合优化的方法提高大鼠的存活率和有效率。李应东等采用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉、直视下经口腔气管插管、开胸行冠脉左前降支结扎法建立大鼠心梗模型取得了较高的成功率。张治国等采用导丝逆行牵拉方式进行气管插管对大鼠心梗模型制作方法进行改进,亦获得了较高的成功率。但是在提高模型制作速度方面的研究则较少。魏峰等对非人工通气条件下建立大鼠心梗模型进行了尝试,该研究使得整个手术操作需时缩短,造模效率大幅提高,同时也利于术后恢复。但是该制作方法仍以使用呼吸机为前提条件,使速度的提高受到一定限制。造模过程中摒弃呼吸机是提高速度有效的方法之一,本课题组在2005年完成的“大鼠冠状动脉结扎心肌缺血模型方法的改进”一文中报告了建立不用呼吸机制作心肌缺血模型的新方法,使得造模速度显著提高,可以在(292±18)s内完成1只模型的制作。经过多年的积累,我们发现在实验人员合理分工的情况下,通过结扎冠状动脉1次,可以在对大鼠心梗面积没有影响的前提下显著缩短开胸时间和结扎心脏时间,与结扎2次冠状动脉比较差异有统计学意义,开胸时间可以在15s内完成,此试验显示通过合理的安排可以达到在1天的时间内完成1项实验模型制作的目的。模型制作速度调高后,保证质量成为面临的主要问题,本实验研究结果显示,使用戊巴比妥钠作为麻醉剂可以提高心梗面积的清晰度。心梗模型制作过程中应注意以下几个问题:(1)在较短的时间内完成模型的制作,是造模成功的关键,对于保证手术者的状态、动物状态的稳定较为有利;(2)在麻醉剂的选择上,麻醉剂的给予量与麻醉剂的选择同样重要,基础给药量确定后,应根据动物对麻醉药的反应,适时对给药量进行微调;(3)该模型的制作需要大量的动物练习和较长时间熟练,才能达到快速高效的程度,因此,应根据实际情况每个研究组甚至1个研究单位重点培养1名手术操作者,不宜以研究生等流动人员为主;(4)多人配合十分重要,其中开胸时间段的操作是关键,合理安排分工可以达到快速完成模型制作的目的。(致谢:课题组在制作模型初期以及此后的有关模型的研究中均得到了马晓斌、王杨慧老师的指导和帮助,在此表示衷心的谢意!)将30只大鼠分为结扎冠状动脉时打1个结组和结扎冠状动脉时打2个结组,每组15只;将70只大鼠分为水合氯醛组和戊巴比妥钠组,每组35只。与结扎冠状动脉时打2个结方法比较,打1个结方法对大鼠的心梗面积差异无统计学意义(P>0.05)。但开胸时间和结扎时间均减少,差异均有统计学意义(P<0.01)。与水