植物生理与分子生物学：离子通道与植物细胞信号转导

离子通道与植物细胞信号转导

离子物质的吸收和体内转运Mg2+K+Cl-Fe3+Zn2+NO3-EnergyPO43-CO2O2矿质营养物质：氮(NH4+和NO3-)、磷、钾、铁、镁、铜、锌、钙、等无机离子有机离子：苹果酸、草酸和氨基酸等有机

离子1.磷是生物膜系统的重要成分MaathuisF.,CurrOpinPlantBiol20092.N被称为生命元素3.K＋为植物细胞中浓度最大的阳离子离子通道/转运体是离子吸收、体内运输和信号传递等的主要途径研究离子转运蛋白的最终目的是理解离子营养和信号的作用。从这个角度讲，研究离子通道更像是一种手段和途径。我课题组的主要研究方向植物细胞的极性生长和方向调控机理气孔运动的分子机理离子营养的体内长途转运有机和无机离子的重要作用电生理技术是研究离子通道的重要手段植物细胞离子通道 1)基本知识 2)研究进展今天的讲解内容

通过直接检测跨膜电流信号对跨膜离子通道进行鉴定、特性分析、并研究其生理功能和活性调控机制的技术。可以用于人工脂双层、细胞质膜和细胞器膜通道的功能研究。其原理是离子通道的开放导致带电离子/电荷的跨膜流动，产生电流信号。主要包括膜片钳和电压钳两种常用技术。电生理技术（electrophysiology）是研究离子通道/转运体的关键技术电生理技术的起源和发展1786年，LuigiGalvani首次在生物体发现电现象。因此被认为是电生理学的创始人CarloMatteucci发现生物组织可以产生电流，并导致静息电位的发现。1887年，SidneyRinger建立Ringersolution配方。灌流蛙心的溶液必须含有Na+、K+和Ca2+等离子，并以一定比例混合可以维持蛙心较长时间的跳动。1888年，WaltherNernst建立NernstEquation。5.1902年，JuliusBemstein提出静息电位K+学说，即现代膜假说的基础。6.1976年，Neher和Sakmann创立膜片钳技术，并首次报道膜片钳技术记录到的细胞膜离子通道电流。7.1980年，Neher偶然发现向电极内施加负压能使封接电阻骤然增大到GΩ水平，背景噪音大幅下降，通道电流更加清晰。从此创立Gigaseal的钳制标准。电生理技术的起源和发展8.1981年，Hamil等建立gigaseal基础上的四种膜片钳记录方式，一直沿用至今。9.八十年代逐渐成熟，并开始出现商售的专业设备，推动了对一些重要科学问题的研究。1983年，AxonInstrumentInc成立，开始商售电生理设备。10.NeherandSakmann,1991,NobelPrizeinPhysiologyandMedicineDevelopment。膜片钳技术的起源和发展电生理技术的基本原理（理论基础）I=V/R

生物膜本身是电绝缘的，不允许带电离子自由通过离子通道是离子过膜的唯一途径闭合电路的简单组成电容电阻电池/PC电阻+-+-Whole-cellConfigurationSaltBridge－+BathSolutionProtoplastPipetteSolution高阻封接ReferenceelectrodeGlasspipette0mVVibrationIsolationTable/防震台FaradayCage/屏蔽网InvertedMicroscope/倒置显微镜Micromanipulator/显微操作器Amplifier/信号放大器Interface

betweenAmplifierandPC/接口PCSoftware(pClamp11.0)Pipettepullerandpolisher电生理设备的基本构成膜片钳实验设备膜片钳技术的四种记录方式全细胞（whole-cellconfiguration）单通道（single-channelconfigurations）

1)细胞帖附式（cell-attached）

2)内翻外方式（inside-out）

3)外翻外方式（outside-out）HamilOPetal.1981.PflugersArch391:85-100Inside-outCell-attachedConfigurationWhole-cellConfigurationProtoplastProtoplastOutside-outProtoplast

几种膜片钳钳制方式示意图BathSolution电生理实验电流信号的记录原理C…...……………....………..............O..…...….…..…….....…-180mV-160mVWhole-cellConfiguration常用的实验结果表示方式和几个重要概念I/Vgraph（全细胞和单通道）OpenProbabiliby(开放几率)Conductance(电导)CurrentAmplitude(电流幅度)Currentdirection(电流方向)原始电信号记录和电流方向内向外向0Fanetal.2008PNAS,105:8476-8481全细胞电流的I-V曲线单通道的电流幅度、IV曲线和电导ZhangWetal.2007PlantPhysiol143:1140-1151单通道开放几率的计算方法开放几率是指各个通道处于开放状态的时间总和占记录总时间的比例，如0.2(20%)。具体分析方法是绘制点数-电流幅度关系曲线，用积分的方法计算代表通道开放状态的峰面积占全部面积的比率。OpenProbabilityZhangWetal.2007PlantPhysiol143:1140-1151Conductance

电导：由通道本身的特性决定，与具体实验设计无关。在概念上，生物学中的电导类似于物理学中的电导率。全细胞电流分析主要看单位质膜面积的电流幅度大小。为此，细胞的电容一般要考虑进去。

2.单通道的电流信号的分析，一般是电导和开放几率结合使用。ChannelActivity通道被激活:离子通道活性的变化是通过改变开放频率来实现的，不是简单的完全关闭和完全开放。开放频率的改变表现为开放几率的改变。全细胞电流是离子通道行为的群体表现。通道活性的改变表现为全细胞电流幅度的增大或减小。电流方向与离子流动方向Fanetal.2008PNAS,105:8476-8481Cl-外流全细胞方式K+内流思考题：敲除一个基因后，导致某种细胞全细胞内向K+电流减小的可能原因有哪些？破坏了单亚基通道蛋白的合成；破坏了多亚基通道蛋白的正确组成；突变基因编码的是通道上游调控因子，激活因子，或负调控因子的激活因子；？有机和无机离子的重要作用电生理技术是研究离子通道的重要手段植物细胞离子通道 1)基本知识 2)研究进展内容离子通道的概念

Ionchannelsarepore-formingproteinsthathelpestablishandcontrolthesmallvoltagegradientacrosstheplasmamembraneofalllivingcells(seecellpotential)byallowingtheflowofionsdowntheirelectrochemicalgradient.Theyarepresentinthemembranesthatsurroundallbiologicalcells.Thestudyofionchannelsinvolvesmanyscientifictechniquessuchasvoltageclampelectrophysiology(inparticularpatchclamp),immunohistochemistry,andRT-PCR.

离子通道是一类跨膜蛋白，他们在细胞质膜和内膜上形成亲水性孔道使带电荷的离子能够穿过生物膜，是动植物细胞的上的基本兴奋单元。它们介导有机和无机的离子跨膜运动，产生和传导电信号，以及参与细胞信号转导和各种生理过程，具有重要的生理功能。离子通道的概念离子通道的基本特性1.离子通道的亚细胞定位：细胞质膜和内膜系统,如液泡膜，线粒体膜等等

IonchannelsareIntegralMembraneProtein(IMP)

，whichisaproteinmoleculethatispermanentlyattachedtothebiologicalmembrane.Suchproteinscanbeseparatedfromthebiologicalmembranesonlyusingdetergents,nonpolarsolvents,orsometimesdenaturingagents.

VahisaluT.,etal.Nature2008离子通道蛋白的亚细胞定位IsayenkovS.,etal.PlantCell2011通道蛋白在质膜上的定位通道蛋白在液泡膜上的定位离子通道的基本特性2.对离子的选择性（ionselectivity）多数离子通道只允许一种或几种离子的通过，即对离子具有一定的选择性。离子通道的名称通常以其优先通过的离子命名，如Ca2+通道、K+通道、Na+通道。离子通道的选择性具有相对性：比如多数Ca2+通道允许Ca2+和与Ca2+同族的其它二价阳离子通过，包括Ba2+、Mg2+、Mn2+和Sr2+等,但通透能力大小不一。离子通道对离子的选择性FanLMetal.2001JExpBot.52:1603-1614离子通道的基本特性3.离子通道的方向性：多数离子通道具有一定的方向性，如植物气孔保卫细胞质膜K+通道有内向K+通道和外向K+通道，它们分别由不同的基因编码，介导K+的内流和外流。离子通道的方向性ArabidopsisguardcellKinArabidopsisguardcellKoutFanetal.2008PNAS,105:8476-8481WardandSchroeder,PlantCell1994离子通道与离子转运体的关系离子通过通道是流过，是一个非常快速的过程。离子通过转运子跨膜运动是被运输过去，相对是一个慢速的过程。离子通道像允许水流过的管道，transporter类似于坐船从河的一侧到另一侧去。通道不直接消耗能源物质，而多数transporter需要直接或间接消耗ATP。有些transporter兼具离子通道的功能。离子通道的分类4.离子通道的门控特性：根据离子通道门控特性的不同，可以将离子通道分为三类。1）受体门控的离子通道（ligand-gated），如神经细胞上受神经递质激活的Ca2+通道，普遍存在于动植物细胞受cNMP门控的通道等。（CNGC和GLR）2）电压门控的离子通道（voltage-gated），如植物细胞膜普遍存在的电压依赖性K+通道，通过施加超极化电压或去极化电压就可以将其激活，介导K+流动，产生K+电流。3）张力激活的离子通道（stretch-activated）。离子通道的分类方式有多种根据其门控特性划分：受体门控型、电压依赖型、第二信使依赖型和张力激活型。根据其亚细胞定位划分：质膜离子通道和内膜离子通道根据其离子的选择性划分：阳离子通道（K+，Na+和Ca2+），阴离子通道（Cl-和有机阴离子通道）和水通道等。电压门控的拟南芥气孔保卫细胞K+通道FanLMetal.JEB2001StretchActivatedIonChannelsinATGuardCellsZhangWetal.2007PlantPhysiol143:1140-1151Store-operatedCa2+Channel,CRACM1VigM.etal.Science2006CNGCGLRAnnexinShakerfamilyCLCSLAC1/SLAHsALMTNRTABCtransporters=channels?植物中的离子通道家族阳离子通道阴离子通道/转运体TalkeINetal.TrendsinPlantSciences2008CyclicNucleotideGated(Ion)Channels(CNGCs)Jonathanetal.,2006CNGchannelsinvolveinphotoandolfactorysensingasCa2+channelsinneuronsJonathanetal.,2006Barryetal,2008StructureandregulationofCNGchannelsinmammaliancellsCNGchannelsofphotoreceptorsandolfactorysensoryneuronsGroupIGroupIIGroupIIIGroupIVAGroupIVBArabidopsisCNGCs(CyclicNucleotide–GatedChannels)BalaguéC,etal.,PlantCell.2003.Zelmanetal.,2012StructureofArabidopsisCNGCs因为CaM和CNBD都在C端，其活性调控机制可能与动物细胞的CNGC有很大的不同。KaplanB.etal.,FEBSLetters.2007拟南芥CNGCs家族CNGCs具有保守的离子选择性核心序列—GYGD，是一个离子选择性的filter！/ArabidopsisCNGCs在各种组织均有表达AtCNGC1andAtCNGC2areK+channelsLengetal.2002K+(CNGC1)currentsinoocytesK+(CNGC1)currentsinHEK293Ca2+inhibitsK+(CNGC2)currentsinoocytesExpressionpatternsofAtCNGC2-promoter::GUSfusionsintransgenicArabidopsisthalianaplants.AnalysisofAtCNGC2geneexpressionasafunctionofthephaseoftheArabidopsiscell-suspensioncultureSAG12isamarkergeneforsenescenceApplicationofSNPReversestheLackofHRofdnd1PlantstoInfectionwithAvirulentPathogenLPS(aelicitorofplantimmunityresponse)ActivationofNOGenerationinWTanddnd1GC.cAMP-gatedCa2+channelcurrentsinguardcellprotoplastsPlantCell,2007rdd1-1(arepressorofdnd1)repressesthecngc2-mediateddelayinfloraltransitionrdd1suppressesthecngc4-mediatedautoimmunephenotypesCNGC2,

CNGC6和CNGC16的突变产生与温度感知有关的表型DeletionofCNGCbCausesaHyper-ThermosensitiveMossPhenotype.GaoFetal.,2012Rootcellscngc6Tunc-OzdemirMetal.,2012CNGC16CNGC3参与种子萌发过程

HeterologousexpressionofCNGC3inyeastG-19,whichlackscationextrusionsystems.EV=emptyvectorYeastCNGC9

cngc9-2plantsshowalteredshootandrootmorphologieswhengrownunderCaCl2stress.Rootlengthofcngc9-2plantsgerminatedongrowthmediacontaining150mMmannitol.TransientexpressionrevealsAtCNGC10-GFPtraffickingtotheplasmamembraneofArabidopsisleafprotoplastsusingconfocallaserscanningmicroscopyExpressionofAtCNGC10-GFPinHEK293cellsandpatchclampassaysTheSeverityofthePhenotypeConferredbycpr22IsDeterminedbytheRatiobetweenATCNGC11/12andATCNGC12.Thecpr22MutantDevelopsaNormalHRafterInfectionwithanAvirulentPathogen.CNGC19CNGC20CNGC20expressioninrootsandshootsCNGC19expressioninvasculartissuesCNGC是候选的气孔保卫细胞质膜Ca2+通道Allenetal.,Nature2001胞质Ca2+震荡控制气孔关闭运动胞质Ca2+震荡调控CO2诱导的气孔运动Youngetal.,PNAS2006Allenetal.,PlantCell2002ABA激活的气孔保卫细胞Ca2+电流

cngc5-1cngc6-1突变体缺失cGMP诱导的保卫细胞内向Ca2+电流WTcngc5-1cngc6-1Wangetal.,PlantPhysiol2013MutationsofCNGC1+20,CNGC2,GCA2andABI1-1donotaffecttheactivationofICabyBr-cGMPgca2abi1-1Col-WTcngc1+20cngc2Ler-WTWangetal.,PlantPhysiol2013花粉管准确向胚囊方向生长，直至到达胚囊；人为去除或破坏胚囊，花粉管以随机的方式生长，失去其方向性。胚囊的引导作用Hülskamp等，1995胚囊可能产生某种引导信号，引导花粉管的定向生长。花粉管顶端胞质自由Ca2+梯度的形成、维持、及其振荡机制是研究花粉管生长机制的关键Ca2+梯度与花粉管生长均具有振荡特点

自由Ca2+梯度的存在为花粉管生长所必须破坏Ca2+梯度，花粉管生长随之受抑直至停止

Ca2+梯度的出现是花粉管恢复生长的必要条件

Ca2+浓度的对称性控制着花粉管生长的方向花粉管顶端Ca2+梯度Pierson

etal.,DevBiol1996;MesserliandRobinson,JCS1997H+(orCa2+)ATPADP+PiCa2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+HighCa2+LowCa2+IP3花粉管顶端可能存在Ca2+通道，介导胞外Ca2+内流ROP1和微丝骨架参与花粉管生长调控，且与Ca2+密切相关顶端微丝Rop1OELatAFuetal.,JBC2001DuttaandRobinson,PlantPhysiol2004花粉质膜超极化激活Ca2+电流WCSingle-channel花粉管质膜超张力激活Ca2+电流Wangetal.,2004花粉粒/管质膜Ca2+电流cAMP影响百子莲花粉管生长方向Moutinho等，2001，CNGC18的突变导致雄性不育CNGC7-YFPCNGC8-YFPCNGC16-YFPCNGC18-YFPFrietschetal.,PNAS2007Changetal.,JIPB2007CNGC18isessentialforpollentubeinitiationFrietschSetal.,2007CNGC7，8，16和18参与花粉萌发和花粉管生长Thecngc7/8pollentransmissiondefectcanberescuedbyCNGC7and8transgenesMutantcngc7/8pollengrainsburstduringinvitrogerminationCNGC7定位在顶端侧面质膜上Tunc-OzdemirMetal.,2013CNGC18isaCa2+channelGaoetal.,2014C-terminalisimportantCarboxyl-terminaldeletionsoftheAtCNGC1codingsequenceaffecttheabilityofthechanneltocomplementgrowthinhibitionoftrk1,2atlowK+.CalmodulinRegulationTheC-terminusofCNGC20interactswithcalmodulinsbutnotcalmodulin-likeproteins.IQ(isoleucineglutamine)motifwithinCNGC20CPK32RegulatesCNGC18FRETAnalysisofCACPK32InteractionwithCNGC18CNGC家族的研究现状通道离子选择性表达部位生理功能CNGC1Ca2+根Ca2+

uptakeCNGC2/DND1Ca2+茎和叶Senescence,defenceCNGC3Na+，K+（非选择性)根SeedgerminationCNGC4/DND2未知叶肉细胞DefenceresponsesCNGC10Ca2+，Mg2+，K+etal根CationuptakeCNGC11CNGC12Ca2+，Mg2+

等叶ProgrammedcelldeathCNGC18Ca2+花粉和花粉管花粉管形态建成和极性生长CNGC19CNGC20根茎叶耐盐反应总体来讲，部分AtCNGCs被发现参与某些生物学过程，其突变产生某种表型。但是,简单的对某些单/双突变体进行分析，似乎有明显的限制，导致对其功能的分析无法得到清晰的结论。绝大多数CNGC的离子通道特性，特别是离子选择性并没有得到细致准确的鉴定（因为技术限制）。过去的“多数CNGCs是K+通道”的推测可能并不正确。绝大多数CNGC具体在哪一种细胞中有功能，具体机理等等，其实还是相当的模糊。思考题：你认为，除了基于单/双突变体的表型分析之外，有什么创新性的方法可以用于对植物CNGC家族的研究？ChiuJCetal.MolBiolEvol2002;Lametal.Nature1998GlutamateReceptor-likeChannelsinArabidopsis(20members)AtGLRs被分成三个CLADESChiuJCetal.MolBiolEvol2002AtGLRs的组织分布ChiuJCetal.MolBiolEvol2002GlutamateReceptor–LikeChannelsinPlantCellsMichardEetal.Science2011ImpairedstomatalclosureNormalCa2+oscillationOElinesdonotmaintainlong-termclosure拟南芥K+和K+通道K+占到植物干重的10%，是必须的大量元素。K+通道是植物吸收、转运和重新分配K+的重要途径。LebaudyA.etal.FEBSLett2007拟南芥K+通道分为三个家族TPK1EncodesanTwo-poreVacuoleK+ChannelLatzA.etal.PlantJ2007LebaudyA.etal.FEBSLett2007TheFunctionsofKir-likeChannelsareUnknownLebaudyA.etal.FEBSLett2007IRC:InwardlyrectifyingconductanceWIRC:WeaklyinwardlyrectifyingconductanceORC:OutwardlyrectifyingconductanceIRCRegul:RegulatorysubunitinvolvedinIRCformation拟南芥SHAKER家族K+通道—细胞质膜K+通道K+的跨膜流动是气孔运动的重要驱动力Ca2+indepROSWardandSchroeder,PlantCell1994拟南芥气孔保卫细胞中表达的K+通道基因内向K+通道：

KAT1、KAT2、AKT1、AKT2和KC2外向K+通道基因： GORKAtKAT1-mediatedcurrentsHoshiT.JGenPhysiol1995KAT2和KAT1组成异源多聚体K+通道，介导气孔保卫细胞K+内流Lebautyetal.,JBC2009KAT1:256(T256R)

262(G262K)KAT1和AKT2Baizabal-Aguirreetal.,JMB1999AtKC1isageneralmodulatorofArabidopsisinwardShakerchannelactivityJeangueninL.etal.PlantJ2011InoocyteFanetal.2008PNAS,105:8476-8481ABA抑制气孔保卫细胞K+inABA诱导K+in蛋白的内化Sutteretal.,CurrBiol2007KAT1-GFPH+-ATPaseSYP121影响KAT1的分布Sutteretal.,PlantCell2006SYP121regulatesKinactivitybyinteractingwithKC1Honsbeinetal.,PlantCell2009CBL-CIPK23参与气孔保卫细胞K+in的调控Cheongetal.,PlantJ2007植株失水GORK在气孔保卫细胞中的表达对ABA不敏感GC:guardcellscc:suspension-culturedcellsBeckeretal.,FEBSLett2003GORK为气孔保卫细胞外向K+通道HosyE.etal.PNAS2003Acheetal.,FEBSLett2000AKT2:pH-andCa2+-sensitiveK+inLatzA.etal.Planta2007Mesophyl根毛中的K+通道ReintanzBetal.,PNAS2002SKORJohanssonIetal.,PlantJ2006SKOR是根组织中表达的外向K+通道SKOR受胞外K+和pH调控AKT1是低亲和性K+通道。因此，多年来，多数人认为其在胞外K+营养缺乏时，并没有显著功能.低钾敏感拟南芥突变体的筛选XuJetal.Cell2006低钾条件下，lks突变体叶子发黄坏死，而野生型基本正常XuJetal.Cell2006LKS的功能恢复和过表达可以恢复/提高其拟南芥对低钾条件的耐受能力说明LKS为K+吸收的关键功能蛋白！LKSencodesCIPK23,whichisaCBL-interactingproteinkinaseXuJetal.Cell2006XuJetal.Cell2006AKT1isthedownstreamtargetofLKSXuJetal.Cell2006AKT1isEssentialforK+uptakeCBL1/9-CIPK23对AKT1的激活对Ca2+具有依赖性Lietal.,PNAS2006SPIKfunctionsinpollentubegrowthasinwardK+channelMoulineetal.,GeneDev2009K+通道的活性调控机制电压：多数K+通道对电压具有依赖性14-3-3：TPK1磷酸化/去磷酸化：AKT1-CIPK23-CBL1/9Ca2+：气孔保卫细胞内向K+通道pH:AKT2功能蛋白的亚基组成：气孔保卫细胞K+in配体：cNMP?CaM?LebaudyA.etal.FEBSLett2007拟南芥K+通道的组织分布阴离子通道/转运体CLC家族NRT家族转运蛋白SLAC1家族ALMT家族AtNRT2.7phloemAtNRT1.9NO3-的吸收木质部装/卸载存储再分配韧皮部往下运输FromTsayLabAtCLCs家族参与形成植物细胞内膜阴离子通道或反向转运蛋白ZifarelliGandPuschM.FEBSLett2010Dechorgnat,J.,etal.JExpBot2011CLC介导NO3-的跨膜运输CLCdAtCLCaFunctionsasNO3-/H+AntiportorMediatingNO3-AccumulationinVacuolesinGuardCellsAngeliAD.etal.Nature2006MonachelloDetal.,NewPhytol2009Openbar:WTBlackbar:clceCLCe参与NO3-的体内积累气孔保卫细胞中的阴离子通道S-typeandR-typeanionchannelcurrentso