电针对下丘脑-垂体-靶腺轴特异性调节规律的实验研究

电针对下丘脑-垂体-靶腺轴特异性调节规律的实验研究

针灸和艾灸的广泛用于治疗妇科内侧疾病，如更年期综合征、更年期提前、不孕症和早熟。但由于性激素分泌的周期性特点,再加上穴位有广泛性效应存在,使临床针灸治疗方案出现混乱无序的状态,虽然所选穴位对生殖内分泌功能都有调节作用,但要判断其特异性和规律性是不可能的。大鼠和人一样具有动情周期,每个周期4～5昼夜分4个阶段:动情间期、动情前期、动情期、动情后期。在动情周期的不同阶段卵巢、子宫及动物性行为的变化直接受性激素的调控,其中下丘脑中的促性腺激素释放激素(Gonadotropinreleasinghormone,GnRH)神经元是控制性激素分泌的直接指导者。许多研究人员从不同的角度研究了下丘脑中与生殖内分泌功能相关的神经元在动情周期中的活性和反应性,发现在动情期因GnRH分泌量多,GnRH相关肽(GAP)和其前体物质在神经元和神经末梢内的含量明显减低,而在动情间期GnRH相关肽及其前体物质则含量多,为下一个动情期的GnRH大量分泌提供了物质基础。GnRH分泌的增加是青春期和动情期的始动因素,如将下丘脑中视交叉上核和内侧视前区间断性损坏,影响雌鼠GnRH神经元的分泌,则可中断动情周期以及黄体生成素(LH)排卵前的大量释放。本实验通过观察雌性成年大鼠动情周期的不同阶段在下丘脑与生殖内分泌相关核团GnRH免疫反应的表达,研究针刺相同穴位在动情周期的不同阶段及不同穴位在动情周期的相同阶段对GnRH分泌的特异性调节规律,为揭示针刺对下丘脑-垂体-性腺轴的调节机理打下基础。1材料和方法1.1gnrh免疫反应的表达及分组雌性生殖龄Sprague-Dawley大鼠,体重240～280g,由中国科学院遗传与发育生物学研究所(SCSK-2002-0016)提供,为普通级动物。标准啮齿类动物饲料分笼喂养,室温:(20±2)℃,光照12h。实验所用GnRH兔抗鼠多克隆抗体(#AB1567,Chemicon,美国),采用MIS2000imaginepro-4.1(美国)图像处理及分析系统测定GnRH免疫反应的表达。实验前2周每天上午8∶00进行阴道细胞学检查,依照施新酞方法确定动情周期的不同阶段,连续观察2个动情周期,选用有正常动情周期的大鼠作为研究对象。大鼠随机分为3个组:“关元”穴组(24只)、“内关”穴组(24只)和假电针组(24只)。每组的24只动物再分为动情间期(6只)、动情前期(6只)、动情期(6只)、动情后期(6只)。每日晨8∶00时取阴道涂片,以确定动情周期的不同阶段。针刺治疗时动物采用10%氨基甲酸乙酯(1.0～1.2g/kg)腹腔注射麻醉。针刺自早晨9∶30时开始,行电针治疗30min后出针。下午15∶00时断头取脑组织。1.2电针刺激试验针刺方法:针刺“关元”穴组将一根针刺在“关元”穴接正级,另一根针刺在“关元”穴的相同经脉线上间隔5mm处接负极。用高性能针灸治疗仪(ZYZ-20GY1)给予电针刺激。针刺“内关”穴组电针方法同“关元”穴组。假电针取穴同“内关”穴,只是不加电流。电针参数为:强度2～5mA,频率20～60Hz,疏密波。针刺“关元”穴时刺激量以阴道口有规律性的收缩为准,针刺“内关”穴时刺激量以前肢有规律性的收缩为度。1.3免疫组化染色于当日15∶00时将动物断头取脑组织,用干冰速冻后在-70℃条件下保存。自下丘脑水平制成16μm厚的连续冠状冰冻切片,每隔4张取1片,用于GnRH免疫组化染色,兔抗鼠多克隆抗体(#AB1567,Chemicon,美国),工作浓度为:2000X,第一抗体于4℃冷房20h、37℃温箱孵育1h。二抗用生物素标记山羊抗兔IgG:100X,室温2h。阴性对照用正常兔血清和0.01mol/LPBS代替第一抗体,正常羊血清代替第二抗体,结果是阴性。1.4gnrh免疫反应表达计数及模型拟合根据大鼠脑立体定位图谱,分别对内侧视前区、弓状核、室旁核部位GnRH免疫反应表达的总数进行统计,并根据其免疫反应着色深浅分“强、中、弱”分别进行统计。在上述3个解剖部位,每只动物每个解剖部位选择观察4个0.05mm2面积进行统计,取其平均值。1.5图像分析、图像处理采用MIS2000imaginepro-4.1(美国)图像分析系统进行分析、图像处理。全部数据以均数±标准误进行统计,不同动情周期之间、不同穴位组之间的GnRH“强”免疫反应表达的比较用方差分析(ANOVA)进行。2“弱”免疫反应GnRH免疫反应表达在下丘脑分布很广,呈弥散分布,没有明显的构筑界线,但基本为“弱”免疫反应表达。针刺后在内侧视前区、弓状核、室旁核等部位出现较多“强”、“中”的GnRH免疫反应表达,其中针刺相同穴位在动情周期的不同阶段、针刺不同穴位在动情周期的相同阶段GnRH免疫反应表达不同,以“强”免疫反应表达最明显。2.1不同动情期的gnrh“强”免疫反应表达在内侧视前区GnRH免疫反应表达分布较多,代表性的免疫组化染色见图1,图中可以形象地看出GnRH“强、中、弱”免疫反应的表达。针刺后在动情周期的相同阶段“关元”“内关”、假电针3个组GnRH免疫反应表达的总数量分别为,动情间期:424,420,400;动情前期:427,440,431;动情期:468,458,457;动情后期:440,425,386。可以看出在动情周期的相同阶段GnRH免疫反应表达的总数量相差不大;在动情周期的4个阶段之间动情期相对其他阶段GnRH免疫反应表达总数略高。值得注意的是在动情周期的相同阶段3个不同组GnRH“强”免疫反应表达有明显不同。“关元”组、“内关”组及假电针组针刺后动情周期的不同阶段GnRH“强”免疫反应表达不同,参见表1。表1示假电针组在4个动情期的GnRH“强”免疫反应表达分别为53±6.61、88±4.16、94±3.65、57±3.11,动情前期和动情期“强”免疫反应表达明显多于动情间期和动情后期。“关元”组、“内关”组在动情周期的不同阶段对GnRH“强”免疫反应表达均有不同程度的增加,与同周期假电针组相比,“关元”组在动情间期、动情前期、动情期、动情后期明显增加(P<0.01,P<0.05),而“内关”组在动情间期、动情后期增加(P<0.01,P<0.05)。针刺“关元”组对GnRH“强”免疫反应表达的促进作用在动情间期、动情期和动情后期较“内关”组明显,两组相比差异有显著意义(P<0.05)。针刺“关元”组与假电针组相比在动情间期、动情前期、动情期、动情后期GnRH“强”免疫反应表达增加的百分率分别为:73.58%、20.45%、30.85%、66.67%。可以看出动情间期和动情后期的GnRH“强”免疫反应表达的增加程度较动情前期和动情期明显。动情间期“关元”组的GnRH“强”免疫反应表达为92±4.76与假电针组的动情前期88±4.16和动情期94±3.65相比无显著性差异(P=0.62,0.78);动情后期“关元”组的GnRH“强”免疫反应表达为95±6.32与假电针组的动情前期和动情期相比亦无显著性差异(P=0.39,0.93)。2.2gnrh“强”免疫反应的表达含量在“弓状核”区,代表性的免疫组化染色参见图2。“关元”组、“内关”组及假电针组在电针后动情周期的不同阶段GnRH“强”免疫反应表达见表2。从表2可以看出“关元”组、“内关”组在动情周期的不同阶段对GnRH“强”免疫反应表达均有不同程度的增加,与同周期假电针组相比,“关元”组在动情间期、动情前期、动情期、动情后期4个阶段均有增加(P<0.01),而“内关”组在动情间期、动情前期亦增加(P<0.05,P<0.01);“关元”组与“内关”组相比在4个期GnRH“强”免疫反应的表达均明显增强(P<0.05,P<0.01)。针刺“关元”组与假电针组相比在动情间期、动情前期、动情期、动情后期GnRH“强”免疫反应表达增加的百分率分别为96.88%、32.81%、34.25%、91.67%,可以看出动情间期和动情后期的GnRH“强”免疫反应表达的增加程度较动情前期和动情期明显。从以上分析看,“关元”与“内关”的调节趋势与内侧视前区是相同的。电针刺后“关元”组、“内关”组在各个周期GnRH“强”免疫反应的表达均有增加,但“关元”组最明显。2.3针刺“关元”组与假电针组gnrh“强”免疫反应表达的比较在“室旁核”,代表性的免疫组化染色反应参见图3。“关元”组、“内关”组及假电针组针刺后在动情周期的不同阶段GnRH“强”免疫反应表达见表3。从表3可以看出“关元”组、“内关”组在动情周期的不同阶段对GnRH“强”免疫反应表达均有不同程度的增加,与同周期假电针组相比,“关元”组在动情间期、动情前期、动情期、动情后期均明显增加(P<0.01,P<0.05);“内关”组在动情间期和动情后期增加(P<0.05,P<0.01);针刺“关元”组对GnRH“强”免疫反应表达的促进作用在动情间期、动情后期较“内关”组明显增加(P<0.05)。针刺“关元”组与假电针组相比在动情间期、动情前期、动情期、动情后期GnRH“强”免疫反应表达增加的百分率分别为73.53%、30.91%、26.09%、69.23%,可以看出动情间期和动情后期的GnRH“强”免疫反应表达的增加程度较动情前期和动情期明显。电针“关元”与“内关”的调节趋势在室旁核与在内侧视前区和弓状核基本相同。3讨论3.1生殖内镜调节GnRH神经元与其他神经元或核团有广泛的突触联系,尤其是那些与性行为有关的神经元或核团,这些神经元通过各种神经递质调节着GnRH的分泌与释放。最近提出它是生殖调控体系的最终共同通路,其合成和释放除了受性激素的反馈调节外与多种神经递质和神经信号的调节有关。许多学者认为雌激素通过调控转录和翻译的修饰过程促进GnRHmRNA的合成,而这种刺激主要作用于喙侧-中隔内侧核-视前区的GnRH神经元。可卡因-苯丙胺调节转录肽是一种在体内分布广泛的神经肽类物质,在生殖内分泌调节中起重要作用。下丘脑室旁核部位GnRH免疫反应表达的部位同时有可卡因-苯丙胺调节转录肽神经元(cocaine-andamphetamine-regulatedtranscriptneurons,CART)。β-内啡肽细胞在下丘脑主要分布于弓状核及其周围,在腺垂体也有广泛分布。人们很早就发现它与性腺轴功能有着密切联系,它可通过抑制下丘脑促性腺激素释放激素的分泌而抑制排卵前LH峰的出现,也可直接抑制垂体细胞分泌LH。正是由于下丘脑内侧视前区、弓状核、室旁核区存在着这些与生殖内分泌功能相关的神经递质及信号转导才使这些区域与生殖内分泌的调节关系密切。针灸作为一种体表刺激能有效调节生殖内分泌系统的功能。因此本课题主要观察了针刺后下丘脑内侧视前区、弓状核、室旁核部位GnRH免疫反应的表达。下丘脑内侧基底部(包括弓状核和腹内侧核)是GnRH的紧张性分泌中心,维持GnRH分泌的基础水平,而下丘脑内侧视前区是GnRH的周期性分泌中心,其功能活动与GnRH的周期性脉冲式的分泌有关,为诱发排卵LH峰产生的重要部位。Giuliano和Mallick等观察到,与性行为有关的刺激在下丘脑内侧视前区都有特殊的反应,说明内侧视前区在调节生殖内分泌功能中起重要作用。Dees等观察到GnRH免疫反应的表达在下丘脑内侧视前区部位较明显。本项研究中也发现针刺后内侧视前区GnRH“强”免疫反应表达的改变最明显,其次是弓状核、室旁核。同时还发现随着雌鼠动情周期的变化中隔内侧核和杏仁核处GnRH免疫反应表达虽然没有室旁核、弓状核、内侧视前区部位多,但亦有不同程度的改变。3.2针刺对gnrh神经元形态和免疫调节的影响实验中发现电针“关元”穴或“内关”穴在动情周期的不同阶段对GnRH免疫反应表达的影响是不同的。从实验结果看,在动情间期和动情后期的免疫增强反应优于动情前期及动情期。分析其原因:下丘脑分泌的GnRH是维持正常性周期所必需的激素,GnRH的合成、释放、降解以及GnRH神经元形态均受雌激素的反馈调节。或许在动情前期及动情期激素水平较高,针刺即使增强GnRH免疫反应表达亦被下丘脑-垂体-靶腺轴反馈性调节,而使其增加的程度受限制。陈伯英等观察了针刺对去卵巢大鼠肾上腺核仁组成区蛋白的影响,并与针刺正常大鼠进行对比,结果显示,针刺能促进去卵巢大鼠肾上腺内侧区细胞的合成代谢,增加肾上腺源性雄激素的分泌进一步转化为雌激素。去卵巢大鼠阴道涂片表现与动情间期和动情后期是比较接近的,也就是说在雌激素水平较低的情况下,针刺的调节作用更明显。赵宏等观察针刺对切除卵巢大鼠下丘脑GnRH及其受体的改变,研究电针对去卵巢大鼠下丘脑GnRH影响的分子机制,结果表明电针可在分子水平调整去卵巢大鼠中枢GnRH的合成与释放以及垂体GnRH受体的表达,并接近正常对照组大鼠中枢GnRH的合成与释放水平。笔者的实验结果与其相吻合。3.3针刺对gnrh免疫反应的影响从实验结果可以看出,“关元”穴对GnRH免疫反应表达的调节明显优于“内关”穴。分析其原因,从解剖学角度看:“关元”穴区与子宫的传入神经均投射在L1～L3之间的脊神经节内,并在此汇聚与重叠,故“关元”与子宫关系密切,可特异性影响子宫的功能。从经络学角度分析:“关元”穴为任脉经穴,任脉经起于胞中,环绕阴器,直接与生殖器相联系;而“内关”为心包经穴,其经脉循行从胸至腹依次联络上、中、下三焦,与子宫是一个间接的联系,故尽管它也能使GnRH的表达增加,但与“关元”穴的效应是不同的。在实验中发现一个重要问题:免疫组化染色的结果显示了“强”、“中”、“弱”GnRH免疫反应表达,在动情周期相同阶段的3个组中,GnRH免疫反应表达的总数无明显变化,但GnRH“强”免疫反应表达3个组之间差异有显著性意义,即在动情周期的不同阶段GnRH“强”