氮替换系数法测定鱼及肉制品中的蛋白质含量

氮替换系数法测定鱼及肉制品中的蛋白质含量

采用硅氮测定方法是最常用的测定蛋白质含量的方法，也是评价蛋白质质量的国家方法。该方法操作简单,测定结果重复性和重现性好,广泛应用于各种食品、饲料、水产等行业的蛋白质含量测定。蛋白质中含有一定比例的氮元素,氮元素含量与蛋白质的含量存在一定的转换关系,即氮换算蛋白质的系数,F。凯氏定氮法首先测定样品中氮的质量,再乘以F值即为样品中的蛋白质质量。通常情况下,蛋白质含氮量在16%左右,其F值为6.25。但是,实际上不同来源的蛋白质的氨基酸组成差别很大,含氮量的差别也很大,如乳制品、面粉、花生的蛋白质含氮量分别为15.67%、17.54%和18.32%,则它们的F值分别为6.38、5.70和5.46。对于鱼类蛋白而言,国家标准中没有列出其F值,研究人员普遍引用肉及肉制品的F值(6.25)来计算其蛋白质含量。但作者在研究鱼肉蛋白过程中多次发现,按此系数计算所得的蛋白质含量常常远高于鱼肉酸水解氨基酸的总量,鱼蛋白粉的蛋白含量测定结果往往超过100%。最初作者认为误差源自不准确的蛋白质系数(6.25),所以在现有的文献基础上计算了鱼肉蛋白含氮量并推导了F值,结果显示鱼肉蛋白含氮量在14%左右,绝大部分鱼蛋白的真实F值在7.0~7.5之间。然而如果根据此系数计算鱼肉蛋白质含量则势必造成计算结果更大的偏离。经初步分析,笔者判断该误差源自鱼肉中存在的非氨基酸态氮(non-aminoacidnitrogen,NAN),如氧化三甲胺及其分解产物、尿素、生物碱等,它们的存在虚高了鱼肉的蛋白质含量。为了使凯氏定氮法能够准确的测定鱼肉及鱼肉制品中的蛋白质含量,并客观、真实的评价鱼蛋白质的营养价值,本文针对氮换算蛋白质系数和如何去除鱼肉中非氨基酸态氮的干扰进行研究,并探讨可行的改进措施。1试样质量分数的测定蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和硫酸铜、硫酸钾一同加热消化,使蛋白质分解,分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离,用硼酸吸收后,以硫酸或盐酸标准滴定液滴定,根据酸消耗量乘以换算系数,即为蛋白质含量。蛋白质含量的计算公式如式(1)、(2)。式中:w为试样中蛋白质的含量/(g/100g);w1为试样中氮的质量分数/%;V1为试样消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积/mL;V2为试剂空白消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积/mL;V3为试样消化液的定容体积/mL;V4为碱化蒸馏的试样消化液体积/mL;c为硫酸或盐酸标准滴定液的浓度/(mol/L);0.0140为1.0mL硫酸(c(1/2H2SO4)=1mol/L)或盐酸(c(HCl)=1mol/L)标准滴定液相当的氮的质量/g;m为试样的质量/g或体积/mL;F为氮换算为蛋白质的系数:一般食物为6.25,乳制品为6.38,面粉为5.70,玉米、高粱为6.24,花生为5.46,米为5.95,大豆及其制品为5.71,肉与肉制品为6.25,大米、小米、燕麦、裸麦为5.83,芝麻、向日葵为5.30。F值计算方法见公式(3)和(4)。式中:N表示蛋白质中总氮含量/%;F表示氮换算为蛋白质的系数;C表示样品中各氨基酸的百分含量/%;n表示氨基酸分子中所含氮原子数;W表示氨基酸的相对分子质量;14表示氮原子的相对原子质量;i取值1到18,表示计算蛋白质氮含量所统计的18种氨基酸。由式(2)可知,试样蛋白质含量测定值是否准确只与两个因素相关,即试样氮的质量分数(w1)和氮换算蛋白质的系数(F)。如要采用凯氏定氮法准确测定试样的真实蛋白质含量,则必须已知正确的F值并测定得出试样真实的蛋白质的氮含量(排除非蛋白质氮干扰)。目前国家标准和水产品行业标准的测定蛋白质的方法(凯氏定氮法)中都没有专门为鱼类明确标示氮换算蛋白质的系数,研究人员和水产行业相关从业人员普遍采用肉与肉制品的换算系数(6.25)。为了改进测定鱼及鱼肉制品蛋白质含量的凯氏定氮法,有必要针对蛋白质换算系数和如何去除鱼肉中非氨基酸态氮的干扰展开深入的探讨。2采用硅氮法测定鱼蛋白2.1鱼类氨基酸态氮含量含量基于文献报道的40种鱼类的肌肉氨基酸分析结果[3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36],按照公式(3)计算得到了40种鱼类的氨基酸态氮(aminoacidnitrogen,AN)含量,根据公式(4)推导出了40种鱼类的F值(表1)。由表1可见,40种鱼的F值均高于目前常采用的6.25,除淡水鱼鲂、罗非鱼和瓣结鱼F值在6.7左右,淡水石首鱼F值为7.9外,绝大部分鱼类的F值在7.0~7.5之间。表2和表3统计数据显示,鲻鱼不同部位、军曹鱼不同生长阶段以及文昌鱼不同性别对氨基酸态氮含量(AN)的影响很小,F值变异系数均小于1%;3种海水鱼(黄颡鱼、石斑鱼、鲻鱼)在不同生长方式(野生/饲养)下氨基酸态氮含量的变异系数均小于1.5%。表4所示的绝大部分海水鱼的肌肉和卵的氨基酸态氮含量的变异系数小于1.5%。由此可见,同一种属鱼类的不同性别、不同部位、不同组织、不同生长阶段、不同生长方式以及肌肉与卵的氨基酸态氮含量的变异程度很小,F值非常接近。由此初步推断,同一种属鱼类的F值相对固定,在凯氏定氮法测定鱼类蛋白质含量时,同种属鱼类采用相同氮换算蛋白质的系数是可行的。2.2鱼类非氨基酸态氮含量的不确定性如上所述,非氨基酸态氮是凯氏定氮法测定鱼蛋白质的另一主要干扰因素。从表5和表6统计数据可见,鱼类的非氨基酸态氮含量(NAN)差异巨大。30种不同种属的鱼类(海水鱼类和淡水鱼类)的非氨基酸态氮的含量差别在2%~30%,并且同一种属鱼类的非氨基酸态氮含量的变异性也很大(变异系数多在50%左右)。虽然统计样本量有限,但是由表6可以看出,同一种属鱼类所处不同育成方式(野生/饲养)其非氨基酸态氮含量也会产生明显差别;鲻鱼不同部位的非氨基酸态氮含量差别很大;雌雄文昌鱼非氨基酸态氮含量也有差别。鲜活鱼类的非氨基酸态氮主要是肌肉内的氧化三甲胺、尿素、嘌呤和嘧啶碱基、咪唑化合物、胍基化合物以及甜菜碱类化合物。鱼死后贮藏过程中在微生物和酶的作用下还会分解蛋白质,产生小分子的氨及胺类化合物使鱼体的非氨基酸态氮含量升高,其生成量与鱼体的腐败程度有相关性。由上述分析可得出一个结论:不同种属鱼类,或同种属的鱼类(海水鱼类或者淡水鱼类),其非氨基酸态氮含量都存在巨大差异。特别是,鱼类还会因为贮藏过程而导致鱼体非氨基酸态氮的含量差异。鱼类非氨基酸态氮含量的不确定性为鱼肉蛋白质含量测定带来了一定的困难。如果要采用凯氏定氮法准确测定鱼肉蛋白质含量,则首先要排除非氨基酸态氮的干扰。3蛋白质含量的测定方法鲜活鱼类的非氨基酸态氮(氧化三甲胺、尿素、嘌呤和嘧啶碱基、咪唑化合物、胍基化合物以及甜菜碱类化合物)和鱼死后贮藏过程中在微生物和酶的作用下产生的氨及胺类化合物具有挥发性,可采用挥发性盐基氮的测定方法(GB/T5009.44—2003《肉与肉制品卫生标准的分析方法》)由凯氏定氮装置在碱性溶液中将这类碱性含氮物质蒸馏出来,以硼酸溶液回收。回收的非氨基酸态氮含量采用凯氏定氮的方法测定,计算非氨基酸态氮的含量。因此,可行的凯氏定氮法测定鱼类蛋白质含量的公式为:式中:w为试样中蛋白质的含量/%;w1为试样中总氮的含量/%;w2为试样中非氨基酸态氮的含量/%;F为已知的某种鱼类的氮换算蛋白质的系数。4氮算蛋白系数分布的变化通过对30种鱼类中非氨基酸态氮含量的分析,证实非氨基酸态氮是凯氏定氮法测定鱼蛋白质含量的主要