实验五-微生物计数法与大小测定

实验五微生物的显微镜直接计数法和大小测定

目的要求了解血球计数板的构造、计数原理和计数方法，掌握显微镜下直接计数的技能。学习使用目镜测微尺和镜台测微尺在显微镜下测定微生物大小的方法。

一、显微镜直接计数法实验材料活材料：酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）培养液。其他器材：显微镜、血球计数板、盖玻（22mm×22mm）、吸水纸、计数器、滴管、擦镜纸。显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。直接计数法优缺点优点：直观、快速、操作简单。缺点：不能区分死菌与活菌，所得为总数；不适于对运动细菌的计数。实验原理常用计菌器常用计数器有血球计数板(血细胞计数板)、Petroff-Hauser计菌器以及Hawksley计菌器等。各种计数板的计数原理相同，只是血球计数板较厚，不能使用油镜观察，只能计数较大的霉菌孢子和酵母菌；而后两种计菌器细菌，可以使用油镜观察，因此可以直接计数细菌。

血球计数板Petroff-Hauser计菌器Hawksley计菌器

血球计数板是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台；中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各列有一个方格网。血球计数板的构造每个方格网共分为九个大方格，中间的大方格即为计数室。计数室的刻度一般有两种规格：一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格；另一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格。无论是哪一种规格的计数板，大方格（计数室）中的小方格都是400个。大方格边长为lmm，则每一个大方格的面积为lmm2，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0.lmm，所以计数室的容积为0.lmm3(万分之一毫升)。A.25中格X16小格B.16中格X25小格计数方法使用血球计数板计数时，通常数5个中方格的总菌数，然后求每个中方格的平均值，再乘上大方格（计数室）中方格的数量，就得出一个大方格中的总菌数。数两个大方格总菌数，平均后，再换算成每毫升菌液中微生物细胞的数量。酵母个体形态制备适当浓度的菌悬液取洁净的血球计数板盖上盖玻片静置3至5分钟低倍镜观察找到位置加样品用高倍镜计数设5个中方格的总菌数为A，菌液稀释倍数为B计数板为25个中方格(本次试验)

：1ml菌液的总菌数=A/5×25×104×B计数板为16个中方格：1ml菌液的总菌数=A/5×16×104×B实验步骤：酵母菌细胞总数的测定用滴管由盖玻片边缘滴一小滴(不宜过多)，则菌液自行渗入，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。

注意事项取样时先要摇匀菌液；加样时计数室不可有气泡；一般样品稀释度要求每小格内约有5-10个菌体为宜；每个计数室选5个中格（4个角和中央）计数；位于格线上的菌体一般数上不数下，数右不数左；若芽体大小达到母细胞的一半，则作为两个菌体计数。血球计数板使用完毕，用水冲洗干净，切勿用硬物洗刷，以免损坏网格刻度；洗净后自行晾干或吹风机吹干。1ml菌液中的总菌数