Tan第二章基因工程的工具酶课件

本课程内容第一章绪论第二章基因克隆的工具酶第三章基因工程的载体第四章目的基因的制备第五章目的基因导入和重组子的筛选第六章外源基因的表达第七章基因操作的根本技术第八章植物基因工程及应用第九章动物基因工程及应用第十章医学基因工程及应用10/1/20231第二章基因工程的工具酶2.1核酸酶2.2甲基化酶2.3连接酶2.4聚合酶2.5修饰酶10/1/202322.1核酸酶

限制性核酸内切酶2.1.1限制性核酸内切酶的类型2.1.2限制性核酸内切酶的命名法2.1.3限制性内切酶的识别序列2.1.4限制性内切酶的切割位点2.1.5限制性内切酶的切割方式2.1.6限制性核酸内切酶的反响体系2.1.7限制性核酸内切酶的星活性2.1.8限制性核酸内切酶对DNA的消化作用2.1.9限制性核酸内切酶酶切本卷须知10/1/20233几乎所有的生物都能合成自身所需要的酶，包括许多病毒。酶参与所有生命活动过程，其在细胞内的分布、含量、活性等随生物生长、发育及外界条件的改变而改变。Ribozyme：具有催化能力的RNA。酶不都是蛋白质。定义：由活细胞产生，能在体外和体内起同样催化的一类具有特殊空间结构的生物大分子，包括蛋白质和核酸等。10/1/20234限制性内切酶〔Endonucleosase〕的发现50年代初发现细菌能将外来DNA片段在某些专一位点上切断，从而保证其不为外来噬菌体所感染，而其自身的染色体DNA由于被一种特殊的酶所修饰而得以保护，这种现象叫做限制－修饰，它们由三个基因位点所控制：hsdR,hsdM,hsdS,十年后，人们搞清了细菌的限制与修饰分子机理：

hsdR限制性内切酶

hsdM限制性甲基化酶

hsdS控制两个系统的表达10/1/202351968年Smith等人从流感嗜血杆菌株中别离出两个类内切酶，HindII和HindIII，为基因工程技术的诞生奠定了根底。

截止到目前为止，已经别离出400余种II类酶，搞清识别位点的有300种，商品化的约有100种，而实验室常用的有20种。10/1/20236III类：识别位点严格专一〔不是回文序列〕，但切点不专一，往往不在识别位点内部。2个亚基组成：HsdM－甲基化HsdR－限制性内切酶功能需要ATP、Mg2+，类似于I应用同样受限制。10/1/20239II类：识别位点〔回文序列〕严格专一，并在识别位点内将双链切断。因此在基因工程中具有实用价值的是II类限制性内切酶。应用最广，酶最简单(Mg2+)，不需要特殊条件具有两个亚基：HsdM－甲基化HsdR－限制性内切酶功能切割特异10/1/2023102.1.2限制性核酸内切酶的命名法用属名第一个字母和种名的头两个字母组成的3个字母斜体的略语表示寄主菌的物种名以及菌株〔型〕的代号命名。该菌株〔种〕中发现的不同的酶按照顺序以罗马字母编号I,II,III等。如：Escherichiacoli用Eco表示。第四个字母代表菌株或株型、变种名，假设酶存在于质粒上，那么需大写字母表示非染色体遗传因子。例：HindIII从流感嗜血菌株〔HaemophilusInfluenzue〕d株中别离的第三个酶。EcoRI表示基因位于Escherichiacoli中的抗药性R质粒上。10/1/202311derivation：firstthreenamesfromthelatinnamesofthemicroorganismthatproducesthem.firstletter(genus),nexttwoletters(species)writing：前三个字母用斜体，其他用正体表示。如果酶存在于一种特殊菌株中，三个字母后加上菌株名称符号,名称最后局部往往包含罗马数字,表示在该特殊菌株中发现这种酶的先后次序。10/1/2023122.1.3限制性内切酶的识别序列识别序列指限制性内切酶在双链DNA上能够识别的特殊核苷酸序列专一通常4～6个特定的核苷酸对组成迴文结构(palindromicsequence)或旋转对称或二重互补对称10/1/202313recognitionsequence:cleaveDNAsymmetricallyinbothstrandsatshortpalindromic(symmetrical)recognitionsequencestoleavea5’-phosphateanda3’-OH.Theyleavebluntends,orprotruding5’-or3’-termini.EcoRⅠ:

↓*5＇GAATTC3＇3＇CTTAAG5＇

*↑10/1/202314

recognitionsequence

enzymes

5＇GTTAAC3＇HpaⅠbluntend3＇CAA↓TTG5＇

5＇G↓AATTC3＇EcoRⅠ5’protrudingend3＇CTTAA↑G5＇

5＇A↓AGCTT3＇HindⅢ5’protrudingend3＇TTCGA↑A5＇

5＇G↓GATCC3＇BamHⅠ5’protrudingend3＇CCTAG↑G5＇

5＇CTGCA↓G3＇PstⅠ3’protrudingend3＇G↑ACGTC5＇

10/1/202315识别序列在DNA上出现的概率1/4n〔n＝识别序列核苷酸组成的数目〕Sau3A4碱基酶,那么每隔256(44)bp会出现一个识别位点。EcoRI、PstI6碱基酶，那么每隔4096(46)bp会出现一个识别位点。NotI(8bp)=1/4865536，稀切酶〔rarcutters〕:指识别序列长和识别序列富含GC或富含AT的限制性核酸内切酶。仅是理论推测10/1/202316同裂酶(isoschizomer)或异源同工酶:不同来源的限制酶可切割同一靶序列BamHI和BstI具有相同的识别序列G

GATGC同尾酶(isocaudiners)：来源不同、识别序列不同，但产生相同粘性末端的酶。两个同尾酶形成的黏性末端连接之后，一般情况下连接处不能够再被其任何一种同尾酶识别。如：BamHI识别序列：G

GATCCBglII 识别序列：A

GATCT

10/1/202317远距离裂解酶(distantcleavage)：识别位点与切割位置不一致。如：FaqIGGGAC(10/14)5'-GGGACNNNNNNNNNNNNNNNN-3'3'-CCCTGNNNNNNNNNNNNNNNN-3'可变酶：识别序列中的一个或几个核苷酸是可变的。如：BseJIGATNN

NNATCSubset酶：一种酶的识别序列包含于另一些酶的识别序列之中。如：EheIGGC

GCC

Hin6IGC

GC10/1/2023182.1.4限制性内切酶的切割位点切割位点：DNA在限制性核酸内切酶的作用下，两条链断开的位置。一般在识别序列的内部或两侧附近。以或表示。环状DNA分子上某个限制性内切酶有n识别位点，完全切割得到n个DNA片段。线性DNA分子，那么会得到n+1个DNA片段。10/1/202319RestrictiondigestsdigestionofplasmidorgenomicDNA,foranalyticalorpreparativepurposes,usingcommercialenzymesandbuffersolutions.AllRErequireMg2+,usuallyataconcentrationofupto10mM,butdifferentenzymesrequiredifferentpHs,NaClconcentrationsorothersolutionconstituentsforoptimumactivity.10/1/2023202.1.5限制性内切酶的切割方式交错切割〔staggeredcut〕:DNA双链断开的位置对称地分布在识别序列中心位置的两侧，使切割后的DNA末端为单链突出的黏性末端。如：BamHI-GGATGC--CCTACG-平切割：DNA双链断开的位置处在识别序列的对称中心，使切割后的DNA末端为平齐的平末端。如：NsbITGCGCA10/1/202321粘性末端和平末端粘性末端(cohesiveterminus/stickyends)：DNA末端一条链突出的几个核苷酸能与另一个具有突出单链的DNA末端通过互补配对粘合，这样的DNA末端，称为粘性末端。3’粘性末端：3’突出的黏性末端〔DNA末端的3’端比5’长〕5’粘性末端：5’突出的黏性末端〔DNA末端的5’端比3’长〕平末端〔bluntends〕：DNA片段的末端是平齐的。10/1/202322同尾酶〔isocaudamer〕指来源不同，识别序列不同，但可以产生相同黏性末端的限制性内切酶。两个同尾酶形成的黏性末端连接之后，一般情况下连接处不能够再被其任何一种同尾酶识别。如：BamHI识别序列：G

GATCCBglII 识别序列：A

GATCT

10/1/2023232.1.6限制性核酸内切酶的反响体系底物DNA2.1.6.2酶量2.1.6.3反响缓冲液2.1.6.4反响温度10/1/2023242.1.6.1底物DNA进行大量酶切时，先要确定RE的浓度。一般1URE于37℃条件下作用底物DNA1h以上可切割1μgDNA。一般来说，要用2～3倍才能保证完全消化，对基因组DNA尤其如此。酶切基因组DNA是否完全可通过紫外观察结果来判断，如看到DNA片段呈均一递减的一条区带，那么表示酶切完全。进行大量酶切时，先要确定RE的浓度。一般1URE于37℃条件下作用底物DNA1h以上可切割1μgDNA。一般来说，要用2～3倍才能保证完全消化，对基因组DNA尤其如此。酶切基因组DNA是否完全可通过紫外观察结果来判断，如看到DNA片段呈均一递减的一条区带，那么表示酶切完全。水稻基因组的EcoRI酶切10/1/2023252.1.6.2酶量根据酶的活性和DNA底物的量而定。限制性核酸内切酶活性单位定义：在酶的最适反响条件下，在50μl容积中，60分钟内完全切割1gDNA所需的酶量为1个酶活性单位〔unit或U〕与DNA分子上识别位点的密度有关：密度大用酶量多；密度小用酶量少。10/1/2023262.1.6.3反响缓冲液Tris-HClorTris-HAcMgCl2orMgAc2KAcorNaCl二硫基苏糖醇(DTT)or-巯基乙醇(ME)牛血清白蛋白(BSA)pH7.5~8.0at37C10/1/2023272.1.6.4反响温度和时间大多数限制酶的反响温度为370C。个别特殊的内切酶那么需要在300C、500C、600C或650C的温度下进行切割。反响时间：一般在适宜的缓冲液和温度条件下，每微克DNA用1~5单位的酶，保温1~2小时。10/1/2023282.1.7限制性核酸内切酶的星活性星活性〔staractivity〕：指限制性内切酶在非标准条件下，对与识别序列相似的其它序列也进行切割反响，导致出现非特异性的DNA片段的现象。易产生星活性的内切酶用*标记。如：EcoRI*

10/1/202329引起星活性的原因：假设使用buffer不當,會有staractivity，而staractivity是指限制酶對所作用的DNA及序列失去專一性,當酶辨認切割位置的能力降低，導致相似的序列或是錯誤的辨認序列長度也會作用，而產生錯誤的結果。所以當DNA同時以兩種限制酶處理時，選擇可使兩種酶之活性反應均可達75﹪以上的restrictionbuffer，假设找不到適當的buffer則先加低盐的buffer使其中一酶作用後，在参加高盐buffer使另一酶作用，假设無法以鹽的上下分別参加不同的buffer，則先参加一種buffer作用後，加3MNaOAc/95﹪alcohol沉澱DNA，再加另一種buffer作用。10/1/2023302.1.8限制性核酸内切酶对DNA的消化作用单酶切:加单一酶双酶切:加两种酶局部酶切:一般通过控制酶切时间,使DNA局部酶切底物位点优势效应:酶对同一个DNA底物上的不同酶切位点的切割速率不同10/1/2023312.1.9酶切本卷须知选择正确的酶DNA的纯度和浓度反响体系甘油的量<5%〔酶保存在50％甘油中，故所加酶液体积最多为酶切反响总体积的1/10〕。酶保存在－200C；使用时在冰浴上操作。反响体系各成分都加完后，再加酶。每次取酶液用新的枪头，防止交叉污染。酶切样品多时，可先取一定量的酶液，稀释后再分装。防止任何可能引起酶蛋白变性的因素，如：气泡、去污剂等。10/1/2023322.2甲基化酶

在专一位点上甲基化，与限制性内切酶相对应。〔一〕大肠杆菌中的甲基化酶

dam甲基化酶:可在5'GATC3'序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基，这样可使一些识别顺序中含有5'GATC3'的限制性内切酶不能切割来自大肠杆菌的DNA如BclI〔TGATCA〕，但BamHI〔GGATAA〕那么不会因为N6A的甲基化而失去活性，因为这两种酶对底物的特异性不同。

dcm甲基化酶此酶在序列5'CCAGG3'或5'CCTGG3'中的胞嘧啶C5上引入甲基，受其影响的限制性内切酶是EcoRII。10/1/202333〔二〕甲基化酶在基因工程中用途

许多II类限制性内切酶，都存在着相对的甲基化酶，它们可修饰限制酶识别顺序中的第三位腺嘌呤上，封闭酶切位点，从而使其免受切割。如：M.EcoRI催化s-腺苷-L-甲硫氨酸〔SAM〕的甲基转移到EcoRI识别顺序中的第三位腺嘌呤上，从而使DNA免受EcoRI的切割。10/1/2023342.3DNA连接酶(DNAligase)2.3.1E.coli和T4DNA连接酶2.3.2DNA片段之间的连接2.3.2.1具黏性末端的DNA片段之间的连接2.3.2.2具平末端DNA片段之间的连接2.3.2.3DNA片段末端修饰后进行连接2.3.2.4DNA片段加连杆〔linker〕后的连接10/1/2023352.3.1DNA连接酶〔DNAligase〕来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌，催化双链DNA片段紧靠在一起的3‘羟基末端和5’磷酸基团末端之间形成磷酸二酯键。用途：具有修复单链或双链的能力,在DNA重组、复制和损伤后的修复中都起关键作用。提取：许多原核和真核生物及病毒中。10/1/202336E.coli

DNAligase和T4DNA连接酶E.coliDNAligase:Mr=74000,作用于5'端带磷酸基团的DNA底物NAD+可促进该催化反响分子克隆使用不多，亦不能连接RNA。用途:cDNA第二链合成。10/1/202337T4DNAligase:

一条多肽链(Mr=68000)，还可作用于RNA,但效率低得多,需ATP作辅因子。日常用的最多。T4RNAligase:由噬菌体编码催化单链DNA或RNA连接。主要用途是对RNA进行3＇末端标记10/1/2023382.3.2.1具黏性末端的DNA片段之间的连接一般较好连接，直接参加缓冲液和T4DNA连接酶就可以完成。10/1/2023392.3.2.2具平末端DNA片段之间的连接连接效率较粘性末端低，尽量防止采用。参加缓冲液和T4DNA连接酶就可以完成。10/1/202340affectingfactorsT：多数内切酶产生的粘性末端的Tm值在15℃以下,然而保持连接酶活性的最适温度却是37℃,因此最适温度是粘性末端的Tm值和连接酶最适温度的折衷。经常采用12.5℃〔4-15℃〕。DNAconcentrations：外源片段浓度比载体DNA浓度高10-20倍防止环化：碱性磷酸酶预先处理质粒载体time：O/Nbetter10/1/2023412.3.2.3DNA片段末端修饰后进行连接DNA片段末端同聚物加尾后进行连接，也称人工接尾法：在末端核苷酸转移酶的催化下，在连接处的末端分别加上AAA，另一端加上TTT。粘性末端修饰成平末端后进行连接：一端是粘端，另一端是平端。DNA片段5’端脱磷酸化作用后连接：防止自身连接环化。10/1/2023422.3.2.4DNA片段加连杆〔linker〕后的连接连杆/衔接物〔linker〕：化学合成的8～12个核苷酸组成的寡核苷酸片段。以中线为轴两边对称，其上有一种或几种限制性核酸内切酶的识别序列，酶切后可产生一定的粘性末端，便于与具有相同粘性末端的另一DNA片段连接。衔接头/接头〔adaptor〕：化学合成的寡核苷酸，含有一种以上的限制性核酸内切酶识别序列。其一端或两端具有一种或两种内切酶切割产生的黏性末端。都具平末端的两种DNA片段的加连杆的连接分别具平末端和粘性末端的两种DNA片段的加连杆的连接分别具非互补粘性末端的两种DNA片段加连杆的连接10/1/2023432.4聚合酶2.4.1DNA聚合酶2.4.2反转录酶2.4.3RNA聚合酶10/1/2023442.4.1DNA聚合酶(DNApolymerase)E.coli（全酶）DNA聚合酶IKlenow片段T7DNA聚合酶TaqDNA聚合酶性质53聚合酶35外切酶53外切酶53聚合酶35外切酶无小亚基活性53聚合酶35外切酶聚合速度和持续合成能力强53聚合酶耐高温持续合成能力高用途缺口翻译法合成放射性标记的探针使粘性末端转换为平末端随机引物法合成放射性标记探针修补3

隐蔽的粘性末端为平末端DNA3

末端标记cDNA第二链的合成测序酶DNA3

末端标记使粘性末端转换为平末端PCR10/1/2023452.4.2反转录酶(reversetranscriptase)依赖RNA的DNA聚合酶〔RNA-dependentDNApolymerase〕最常见的商用反转录酶：来源于禽类骨髓母细胞瘤病毒〔avianmyeloblastosisvirus,AMV〕。AMV反转录酶具有反转录酶活性和RNaseH活性反转录酶活性可以单链RNA或DNA为模板，以寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷[olig(dT)]或随机寡聚脱氧核苷酸为引物合成同模板序列互补的互补链。但DNA指导的DNA聚合酶特性，不具有35外切酶活性，聚合时无校正功能。RNaseH具有核酸外切酶活性，能以53或35方向特异地降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链。最主要的用途：以mRNA为模板合成cDNA。10/1/2023462.4.3RNA聚合酶(RNApolymerase)以DNA为模板合成mRNA，不需引物，但必须有启动子。常用的RNA聚合酶来源与SP3、T3和T7噬菌体。用途：RNA探针的合成。10/1/2023472.5修饰酶末端转移酶(terminaldeoxynucleotidyltrasnferase/terminaltransferase)：不依赖于DNA的DNA聚合酶，来自于小牛胸腺组织，在DNA分子的3

端增加一个或多个脱氧核苷酸。T4多核苷酸激酶(bacteriophageT4polynucleotidekinase)(nextpage)碱性磷酸酯酶(alkalinephosphatase):(nextpage)Topoisomerase改变共价闭合双链DNA分子的结构10/1/202348T4多核苷酸激酶(bacteriophageT4polynucleotidekinase)：激酶:对核酸末端羟基进行磷酸化的酶。用途：放射性标记DNA链的5'末端，探针标记Maxam-Gilbert化学法的DNA序列分析；使缺少5＇磷酸的DNA片段和合成接头磷酸化。该酶很难纯化,酶制品经常不纯。铵离子是该酶的强烈抑制剂,处理前,DNA不能溶解于含铵盐的缓冲液中。低浓度的磷酸也可抑制该酶活性。10/1/202349碱性磷酸酯酶(alkalinephosphatase):磷酸酶：去除核酸末端磷酸基团的酶。细菌碱性磷酸酶(BAP)：E.coli中别离牛小肠碱性磷酸酶(CIP)：牛肠道别离，切除DNA、RNA和dNTP上的5＇磷酸基团,从DNA片段上除去5＇磷酸以防自身连接。

BAP活性更高,对热和去污剂抗性更强,因此脱磷酸化后很难完全抑制BAP活性。除去CIP可用蛋白酶K降解10/1/202350