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基因组测序原理基因组测序原理第一代测序技术第二代测序技术第三代测序技术第一代测序技术1、化学降解法

在该方法中,一个末端被放射性标记的DNA片段在5组互相独立的化学应中分别被部分降解,其中每一组反应特异地针对某种碱基。因此生成5组放射性标记的分子,每组混合物中均含有长短不一的DNA分子,其长度取决于该组反应所针对的碱基在原DNA片段上的位置。最后,各组混合物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离,再通过放射自显影来检测末端标记的分子。准确性好，易掌握，但操作麻烦2、双脱氧链终止法（Sanger法）

核酸模板在DNA聚合酶、引物、4种单脱氧核苷三磷酸(dNTP,其中的一种用放射性P32标记)存在条件下复制时,在四管反应系统中分别按比例引入4种双脱氧核苷三磷酸(ddNTP),因为双脱氧核苷没有3-OH,所以只要双脱氧核苷掺入链的末端,该链就停止延长,若链端掺入单脱氧核苷,链就可以继续延长。如此每管反应体系中便合成以各自的双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后,分4个泳道进行凝胶电泳,分离长短不一的核酸片段,长度相邻的片段相差一个碱基。经过放射自显影后,根据片段3’端的双脱氧核苷,便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。操作简单，应用广泛。Sanger双脱氧末端终止法测序原理3、荧光自动测序技术荧光自动测序技术基于Sanger原理,用荧光标记代替同位素标记,并用成像系统自动检测,从而大大提高了DNA测序的速度和准确性。4、杂交测序技术不同于化学降解法和Sanger法,而是利用DNA杂交原理,将一系列已知序列的单链寡核苷酸片段固定在基片上,把待测的DNA样品片段变性后与其杂交,根据杂交情况排列出样品的序列信息。该方法检测速度快，但误差较大，且不能重复测定。第二代测序技术（合成测序）第二代测序流程：1、454测序技术：

使用的是焦磷酸测序技术。首先将基因组分割为长度为300到500个碱基对的片段,然后将双链解开,弃去互补链当中的一条,将另一条链与连接在塑料小珠上的复合物结合,并使得每个珠子只与一条链发生结合。随后PCR,对结合在小珠上的片段进行复制,直到各个片段的拷贝完全覆盖其所在的小珠为止。接下来将珠子分散在一个包含大约160万个小孔的平板上,并加入一系列的测序试剂和核苷酸。每当一个核苷酸被添加到正在延伸的DNA链当中时,该反应会释放一个焦磷酸(PPi)分子,随即在ATP硫酸化酶的催化下与腺苷酰硫酸反应生成ATP,在位于小孔中的荧光素酶催化下该ATP被用于促进D-虫萤光素发光。用CCD将每个微球发出光及其强度进行

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