电纺复合纤维膜的制备及其细胞的体外培养

电纺复合纤维膜的制备及其细胞的体外培养

膜是眼睛的透明部分，覆盖着膜、瞳孔和前室。这是一个重要的光谱手段。光线通过膜和龚膜后，可以准确地聚焦在视网膜上形成清晰的图像。作为眼腈的第一个屏障，该膜完成了90%以上的光学功能，在维持视觉方面发挥着重要作用。然而，由于外部或自身疾病的影响，分子组织容易受到外部或自身疾病的损害，导致虚弱和眼盲。目前,治疗角膜盲最有效的方法是角膜移植,但因角膜供体严重缺乏、术后发生免疫排斥反应和医源性散光等问题而受到限制.组织工程角膜技术的兴起为治疗各种可导致失明的角膜疾病带来了希望.该技术的基本方法是取少量健康角膜缘组织,经体外培养扩增后种植于一种生物相容性良好的载体上,在体外形成结构与自体角膜相似的组织工程角膜片,再移植到患者眼表.近20年来,应用组织工程技术构建角膜组织的研究取得了很大进展[1~5].然而,组织工程角膜支架的制备仍面临巨大的挑战.基于角膜组织工程技术的设想,角膜组织工程支架主要用于模拟细胞外基质、支撑细胞黏附并为组织形成提供场所.因此,理想的组织工程角膜支架要求其表面有利于角膜细胞黏附及增殖,形成稳定连续透明的角膜.目前常用的角膜材料有动物胶和黏多糖.其中,明胶由胶原蛋白经缓和水解制得,其化学组成与胶原相似,亲水性强,生物相容性好,有利于保持细胞活力[5~9].但单纯明胶形成的膜质较脆,力学性能欠佳,缝合时易撕裂,不能满足移植手术的缝合要求.人工合成材料如聚乳酸在组织工程中的广泛应用为组织的培养和重建提供了另一种可选择的载体[5,12,13,14,15,16,17,18],但因疏水性较强,不利于细胞的黏附和增殖,进而限制了其应用.本文将明胶与聚乳酸进行复合静电纺丝,可以最大程度地保留明胶分子链上的精氨酸(R)-甘氨酸(G)-天冬氨酸(D)(RGD)序列,以增加细胞的亲和力,使材料保持良好的生物相容性;同时聚乳酸的加入也可以适当提高支架材料的机械强度,通过调节明胶与聚乳酸的配比调控支架的表面性能和力学性能,使复合纤维膜更适合细胞生长和组织形成,达到角膜上皮组织体外重建的目的.1实验部分1.1d-mem/f-12明胶(猪皮A型),Sigma-Aldrich公司;聚乳酸(PLLA,Mw=3.0×105),山东省医疗器械研究所;六氟异丙醇(HFIP),分析纯,上海晶纯试剂有限公司;D-MEM/F-12,荷兰Gibco公司;胎牛血清,Hyclone公司;抗角蛋白单克隆抗体,博士德生物公司;Hoechest33342,Sigma-Aldrich公司.其它试剂均为分析纯.1.2复合膜的制备将一定量明胶与聚乳酸先后溶于HFIP中,制成溶质质量分数为10%的混合溶液.明胶与聚乳酸的质量比依次为100∶0,85∶15,70∶30,55∶45和40∶60.分别采用JYW-200表面张力仪、SNB-2数字旋转黏度仪和DDS-12型电导率仪测试纺丝液的表面张力、黏度和电导率.设定纺丝电压15kV,流速0.8mL/h,固定喷丝扣与接收板间距离为18cm,于室温(25℃)静电纺丝,制备不同组分配比的明胶/聚乳酸复合纤维膜.所得纤维膜依据质量配比分别简称为G100P0,G85P15,G70P30,G55P45和G40P60.1.3复合膜的性能测试采用傅里叶变换红外光谱仪(BrukerEQUINO55,德国Bruker公司)测定经真空干燥处理的复合膜样品的红外吸收光谱.复合膜喷金后用扫描电子显微镜(JEOLJSM6700F,日本电子公司)观察样品形貌,并利用Photoshop软件统计纤维的平均直径和直径分布.采用毛细管流动孔径分析仪(CFP-1100-AEHXL,PMI公司)测试复合膜的孔隙率.在25℃,65%湿度的条件下,以去离子水为介质,采用接触角测定仪(JC2000C2,上海中晨数字技术设备有限公司)测定复合膜的表面接触角,取5次测定的平均值.将复合膜样品切成直径为15mm的圆片,浸入PBS缓冲液中达到溶胀平衡,48h后取出,用滤纸小心吸干样品表面的水分,测得湿重W1,然后将湿膜于105℃干燥至恒量,置于干燥器中冷却后,测得干重W2.膜片的平衡含水量(SR)根据SR=[(W1-W2)/W1]×100%计算.将干态下的复合膜样品分别切割成50mm×4mm的哑铃型样条,通过微型电子拉力机[HZ(08)X-06,上海黑子仪器有限公司]测试复合膜片的拉伸曲线,并求算抗张强度、弹性模量和断裂伸长率.每个样品的实际测试长度为17.5mm,拉伸速度为10mm/min,每组平行测试3个样条.将复合膜样品在磷酸盐缓冲液(PBS)中浸泡达到溶胀平衡,测试湿态复合膜的力学性能.1.4细胞培养和表征将复合膜圆片浸泡在体积分数为75%的乙醇溶液中,在紫外灯下灭菌30min后,用无菌的Hank’s平衡盐溶液浸泡洗涤3次,浸入DMEM-F12不完全培养基中,于4℃过夜.次日,将膜片分别移至24孔和96孔细胞培养板中,每孔加入500和200μL角膜上皮细胞悬液(密度为1×105Cell/cm2),置于37℃和5%(体积分数)CO2培养箱中培养.96孔细胞培养板中的样品用于常规噻唑蓝四氮唑溴化物(MTT)比色法测试,在酶标仪(ThermoMultiskanMK3,荷兰雷勃公司)上测定490nm处的光吸收值.将24孔细胞培养板中的样品培养72h后在倒置相差显微镜(WilovertAFL20,德国Hund公司)下观察细胞生长情况;用多聚甲醛固定后进行免疫荧光标记,于激光共聚焦显微镜(OlympusFV-1000,日本奥林巴斯公司)下观察细胞的角蛋白表达.2结果与讨论2.1明胶/聚乳酸配比对纤维直径和复合纤维膜表观的影响一系列不同配比的明胶/聚乳酸复合电纺纤维膜的电子显微镜照片如图1所示.可以看出,在相同条件下,各配比所得纤维表面光滑且平直.由图1(F)的透射电子显微镜照片可见,复合纤维两相分布均匀,纤维搭接处直径未发生变化,证实纤维支架为通孔结构,有利于细胞长入支架内部,同时保证了细胞生长所需要的物质交换.当聚乳酸相对质量分数分别为0,15%,30%,45%和60%时,平均纤维直径分别为(1269±67.79),(1299±63.06),(1259±59.20),(1069±55.16)和(921.8±50.13)nm.相对于纯明胶纤维,聚乳酸的加入有效降低了复合纤维的平均直径,并且直径分布也逐渐变窄.这是因为电纺纤维形貌不仅与纺丝条件有关,还与聚合物溶液的物理性质直接相关.图2为混合溶液的表面张力和黏度随明胶/聚乳酸配比的变化曲线.插图为纯明胶溶液的表面张力曲线.由图2可见,聚乳酸的加入显著降低了纺丝溶液的表面张力,增大了黏度.这有利于获得具有更小直径的纤维.表1为明胶/聚乳酸混合溶液的电导率和复合纤维膜的表面性质.由表1可见,聚乳酸的加入减小了纺丝溶液的电导率.因此,在相同静电场作用下,由于其静电诱导作用减弱,可诱导的静电荷减少,所得纤维直径趋于均一.由表1还可见,聚乳酸含量升高,纤维直径减小且趋于均一,孔隙率也随之减小,使得纤维膜的接触角增大,平均含水量降低.聚乳酸含量不高于50%时,纤维膜的孔隙率高于60%,平衡含水量高于68%,纤维膜作为组织工程支架有利于细胞生长.2.2对称变形吸收峰图3为不同配比的复合纤维膜的红外谱图.由图3可以看出,复合膜和明胶膜在1650,1540和1243cm-1处都存在吸收峰,分别对应于酰胺Ⅰ带C＝O伸缩振动吸收峰、酰胺Ⅱ带N—H对称变形吸收峰和C—N伸缩振动吸收峰;复合膜和聚乳酸均在1756,1183和1085cm-1处都存在吸收峰,这是由C—O—C伸缩振动所引起的.由图3可见,随着聚乳酸含量的增加,归属于聚乳酸分子的特征峰逐渐加强,明胶分子的特征峰逐渐减弱.此外,在复合膜的红外谱图中,归属于明胶的N—H和OH—O伸缩振动峰由3379cm-1处蓝移至3276cm-1,证实了分子间存在较弱的氢键作用,有利于明胶和聚乳酸在纤维中的均匀分布.2.3复合膜的拉伸性能对明胶/聚乳酸复合纤维膜进行拉伸测试,结果示于图4(A)和表2.相对于明胶膜,复合膜的弹性模量和拉伸强度均显著提高,断裂伸长率也有所提高;且聚乳酸含量越高,拉伸强度越大.由此可见,聚乳酸的加入可以有效提高复合膜的拉伸性能.为了考察纤维膜作为组织工程支架用于角膜移植的应用性能,进一步测定了水平衡状态下湿膜的拉伸性能.由图4(B)可见,聚乳酸质量分数为15%时,纤维膜呈现断裂脆性.聚乳酸质量分数高于15%时,纤维膜呈现韧性断裂,与天然人角膜具有相近的拉伸强度[(3.81±0.40)MPa],可以满足移植时的缝合要求.因此,在细胞相容性实验中,主要采用G70P30,G55P45和G40P60三种复合膜.此外,比较各拉伸性能参数(表2)可知,湿膜具有较低的弹性模量和拉伸强度,但其断裂伸长率则大大提高.这是水溶胀平衡后纤维膜中水合作用的结果.2.4mtt检测纤维膜的密度通过兔角膜上皮细胞的体外培养评价了复合膜的细胞相容性.采用倒置相差显微镜观察角膜上皮细胞在纤维膜表面的分布情况(图5).结果表明,G70P30和G55P45膜表面的细胞密度较大,而在G40P60膜表面的细胞黏附最少.采用免疫荧光染色对细胞形态进行观察(图6).可见,在G70P30膜上生长的细胞伸展良好,细胞密度最大;G55P45膜次之;而在G40P60膜上生长的细胞形态不规则,细胞密度最小.由此可见,G70P30膜细胞相容性最好.这是由于以明胶为基材所制备的纤维膜表面含有较多来源于明胶分子的RGD序列,有利于细胞的黏附.故明胶含量越高,细胞相容性越好.MTT检测结果(图7)表明,在培养初期,纤维膜的OD值均低于对照组;但培养5d后,各组OD值均有不同程度升高,其中,G70P30膜的细胞增殖最为显著,此结果与上述免疫荧光检测结果一致.培养9d后,对照组OD值维持不变,而纤维膜的OD值仍呈上升