电针内关穴对大鼠急性心肌缺血的自主神经效应及可能的物质

电针内关穴对大鼠急性心肌缺血的自主神经效应及可能的物质

大量实验研究表明，内关-心之间的经络性质与电针内关穴的急性心肌缺血（ami）密切相关。在本实验中，以电针内关穴为干预手段，观察大鼠心感受，迷宫神经发射频率的变化，以及独立神经中枢p物质（sp）和氧氮基因（nos）的散列值，并将其与正常大鼠和ami模型进行比较。以电针内关穴内各功能的自我效能路径和可能有效物质进行了分析，为进一步探索内关-心之间的关系提供了基础。材料和方法1.材料表面1.1实验动物SD大鼠18只,体质量180-200g,雌雄不拘,由华中科技大学同济医学院实验动物学部提供,普通级,动物合格证号:610103。1.2免疫组织化学RbXSubstanceP:100μl,购自CHENICONINTNATIONAL(AM.);即用型SABC免疫组化染色试剂盒:购自武汉博士德生物公司;NADPHNa4:25mg,购自Biosharp(AM.);3-3-DAB.4HCl(3-3二氨基联苯胺盐酸盐):1g,购自Amresco,由荟萃生物公司提供;氯化硝基四氮唑蓝:250mg,购自科瑞生物公司(上海,英国分装)。2.方法2.1股静脉采血试验20%乌拉坦给予大鼠腹腔注射麻醉(5ml/kg),按6U/kg比例股静脉注入垂体后叶素(pituitary,Pit)注射液(6U/ml,蚌埠市宏业生化制药厂,批号020612),观察心电图在1min内出现心率明显减慢、T波显著高耸,或ST段抬高>0.1mV为造模成功。2.2颈下神经节的分离大鼠麻醉后手术台仰卧固定,颈部剪毛,碘伏消毒,在喉头与胸骨间沿颈正中线作长约2.5-4cm的切口,寻找右侧颈动脉鞘(内有颈动脉及迷走神经)后,分离出迷走神经主干约1-2cm,并以4号线从中间引出备用;在左侧颈总动脉后、椎前肌浅面、椎体旁,将椎前筋膜用玻璃分针纵向剥离,找出颈交感干,沿交感干向下找出颈下神经节,用细线穿过神经下方引出备用。将分离的右侧迷走神经、左侧交感神经分别挂上BL-420E+生理仪(成都,泰盟)银丝电极,记录神经放电情况,记录中石蜡油湿润神经,记录时间25min。2.3小鼠海马的脑室镜观察打开大鼠胸腔,经升主动脉插管,先用0.9%NaCl注射液100ml快速灌注,后用4%多聚甲醛的0.lmol/LPBS液(pH7.4)400ml先快速、后缓慢灌注固定50-60min。灌注完毕立即取完整脑组织及C7-T7段脊髓放入上述相同的新鲜固定液中固定4h,再移入25%蔗糖溶液过夜沉底(4℃),次日取出组织作恒冷箱连续冠状切片,片厚40μm。按大鼠脑定位图谱,留海马出现至海马伞体积最大显示之间切片20张/只;切取延髓第四脑室至中央导水管段留片20张/只;切取脊髓C8-T2段留片20张/只。上述切片0.01mol/LKPBS液4℃保存。2.4sp抗体-igg-sp-100-u切片漂洗(入0.01mol/LKPBS液漂洗10min×3次,下同);浸入80%甲醇双氧水(双氧水浓度为0.3%)30min(4℃),漂洗;入含0.3%TritonX-100的0.01mol/L的KPBS缓冲液摇床30min;入SP抗体(稀释浓度1∶1000)4℃孵育48h,漂洗;入生物素化羊抗兔IgG(稀释浓度1∶0)4℃孵育12h,漂洗;入SABC复合水(释浓度1∶0)4℃孵育12h,漂洗;显色,漂洗;贴片,干燥;脱水;明胶封片。2.5u3000结论切片漂洗;入含0.3%TritonX-100的0.01mol/LKPBS缓冲液摇床30min,漂洗;入孵育液(硝基四氮唑蓝2mg溶入含0.3%TritonX-100的0.1mol/LKPBS液10ml中,抽出1ml加入NADPH1mg,37℃2h),漂洗;贴片,干燥;脱水;明胶封片。2.6神经放电检测SD大鼠18只,随机分为正常组(A组)、模型对照组(B组)、电针内关组(C组)3组,每组6只。各组处理方法如下:正常组(A组):分离神经、记录神经放电,分别于第0、3、8、13、23min标记,之后脊髓、脑固定并取材、切片,检测SP、NOS。模型对照组(B组):分离神经、记录神经放电,第3min造模,分别于造模前、造模后0、5、10、20min标记,之后组织固定、取材、切片、检测同A组。电针内关组(C组):分离神经、记录神经放电,造模、标记同B组,造模后5min针刺左上肢内关穴(参照华兴邦“大鼠穴位图谱”,于尺骨、桡骨缝间离腕关节约3mm处取“内关”穴,毫针0.38×15mm)并接G6805-1型电针仪,疏密波(8-80Hz,疏密波转换14次/min,电压1.5V,强度1mA),电针5min后去电针仪继续留针至15min起针。最后组织固定、取材、切片、检测同A组。2.7延髓迷走神经复合区及髓外侧角sp、nos灰值的测定依据国外文献报道,观察各组造模前,造模后0、5、10、20min各时刻迷走神经及交感神经放电频率(Hz)。观测PVN、延髓迷走神经复合区及脊髓外侧角SP、NOS灰度值。运用图像分析系统测定其灰度值是对其免疫组化结果进行量化评价的一种方法,即入射光灰度和它穿过免疫阳性反应产物后的灰度之比的对数值,红光光密度与其含量呈正比,而绿光和蓝光与其含量呈反比。由于SP免疫阳性反应产物呈棕褐色,因此,SP光密度值与其含量呈正比,而NOS免疫阳性反应产物呈蓝色,故NOS光密度与其含量呈比。3.sp、nos免疫阳性基于c8-木糖的血清因子水平图像分析采用HPIAS-1000高清晰彩色病理图文分析系统进行,对棕黄色和蓝色杂交信号进行灰度扫描。每鼠取下丘脑室旁核(PVN)、延髓迷走神经背核、C8-T2各4张,每片于相应部位取3个视野,每项指标共12个视野,分别测定,累加取均值,即为该鼠SP或NOS免疫阳性灰度值。数据以x±s表示,组内比较、组间比较采用SPSS12.0软件进行方差分析,显著性标准为P<0.05。结果1.造模前后放电频率的变化从表1可以看出,造模后各时刻迷走神经放电频率B组与造模前及A组相应时刻相比显示差异性(P<0.05),C组造模后0min与造模前及A组放电频率也显示差异性(P<0.05),均提示心肌缺血造模后引起迷走神经放电频率增加;C组造模后20min(即电针内关结束)迷走神经放电频率降低,与组内造模前及A组同时刻比较无差异,与同时刻B组相比有差异性(P<0.05,提示电针内关穴对急性心肌缺血引起的迷走神经放电有抑制效应。2.内针插入对心脏交感神经放电频率的影响3.组间差异情况从表3可以看出,B组各部位SP灰度值小于A组,并显示出组间差异性(P<0.05);C组各部位SP含量均高于A、B组,组间比较有差异性(P<0.05),提示电针内关后能提高各部位SP含量。4.电针内关治疗对不同部位nos含量的影响由于NOS光密度与其含量呈反比,从表4可以看出,B组各部位NOS含量最低,与A、C组间均显示出差异性(P<0.05),提示造模后NOS在三部位含量降低,电针内关治疗能上调三部位的NOS的含量。sp、nos模型检测一般认为,延髓迷走神经复合区(包括迷走神经背核、孤束核)是支配心自主神经的中枢部位。下丘脑室旁核(PVN)通过下丘脑下行通路使PVN、延髓迷走神经复合区、脊髓外侧角等部位联系起来,在心血管功能活动中起到整合作用。近年来研究表明,神经肽类物质如SP和神经递质NO均参与心血管功能活动的重要调节。NOS是NO生成过程中的最重要的限速因子,是NO合成的关键酶,因此检测组织中的NOS可反映NO生成的情况。在电针内关穴引起自主神经调节抗AMI损伤作用过程中,研究中枢SP、NOS参与机制对于探讨内关-心脏相关有重要意义。本实验观察到,电针AMI模型大鼠内关穴,自主神经放电频率得到不同调整:迷走神经放电频率降低,交感神经放电频率增高,SP、NOS阳性表达在PVN、延髓迷走神经复合区及脊髓(C8-T2)外侧角等部位的表达均增高,推测电针治疗促使自主神经中枢SP合成与释放以及NOS活性增强。脊髓外侧角SP含量增加进而促进交感神经元放电增加,抑制迷走神经放电频率降低,总的效应促使心率加快,房室交界的传导加快,心房肌和心室肌的收缩能力加强,改善心肌缺血;NOS活性增强,催化NO生成,NO具有高度的脂溶性,极易通过细胞膜迅速通过血脑屏障,直接作用于外周血管平滑肌而发挥舒张心血管,同样达到改善心肌供血效应,这与某些药物提高心肌缺血时NOS水平抗心肌损伤疗效相似。有研究发现,SP可通过增强人脐静脉血管内皮细胞内皮型NOS的表达来促进NO的分泌。对于本实验中SP与NOS之间具体的作用机制有待进一步研究。见表1。说明:造模前、造模后0、5、10、20min与A组3、8、13