中医证候模型的建立

中医证候模型的建立

中医证候的动物模型是在中医的一般概念和辩证法效应的指导下，运用内脏象论和中医病因病机理论，模拟和复制人类不同的临床综合征。建立合理有效的中医证候动物模型是实现中医药现代化的关键,是深刻揭示中医药治病机制的载体。理想的动物模型应能真正反映中医“证”的特点,在造模动物、因素、标准及评价方法几个方面规范化。造模评定标准体系做到指标化客观化,宏观微观结合,有利于提高科研工作的准确性。代谢组学为生物体对病理生理或基因修饰等刺激产生的代谢物质动态应答的定量测定,它将人体作为一个完整的系统,机体的生理病理过程作为一个动态的系统来研究。其整体性、系统性、动态性、综合性与中医理论的“整体观”“动态观”“辩证观”相吻合。因此,将代谢组学理念与方法引入中医证候模型研究对实现中医药现代化具有重要意义。病料结合式动物模型根据传统中医理论,将导致“证”的致病因素作用于动物,制造具有人类证候模拟表现的动物模型,分为单因素造模和复合因素造模两种。苦寒泻下药致脾虚,劳力过度致脾虚,“恐伤肾”等均为单因素造模。如刘汶等给予大鼠番泻叶水浸剂灌服制造脾虚证动物模型。引起中医证候的病因具有非特异性特征,单一因素可能无法完全符合要求。复合因素造模的方法弥补了其不足。宋红等以大黄法、游泳力竭法、饥饿法多因素复合建立一种新的脾气虚证大鼠模型,其克服了单因素造模持续时间短、自愈性强的缺点。根据西药的副作用产生类似证候的临床表现建立动物模型,但此类模型不完全符合中医理论。李俊丽等将大鼠灌胃给予甲状腺片悬液制造肾阴虚模型,出现大便干结,饮水量及食量增多、活动频度增加、汗多、毛无光泽、体质量下降或增长缓慢、体温升高、尿量减少等肾阴虚表现。王穆等将小鼠一次性腹腔注射环磷酰胺,造成血虚证模型,观察四物汤对环磷酰胺所致的血虚证小鼠代谢组学变化的影响。病症结合动物模型是指通过临床调查研究,选择有密切联系的疾病和证候,找出两者在临床上的结合点,分别或同时复制疾病与证候动物模型。杜中平等采用腹腔注射利血平的方法制作脾虚动物模型,然后采用尾根部皮下注射Ⅱ型胶原与不完全弗氏佐剂混合物的方法诱导出类风湿关节炎(rheumatoidarthritis,RA)模型,观察脾虚证RA病证结合动物模型的发病情况,并采用酶联免疫吸附测定法等方法对其机制进行初步探讨。肾阴虚模型检测动物的一般状态较易观察。根据中医理论,观察动物的宏观表征。如观察肾阳虚模型多有畏寒喜暖、大便稀溏、小便清长、卷缩拱背、精神萎顿、倦怠嗜睡、自主活动次数明显减少等表现。李志强等制造的脾虚模型组动物在4d后开始出现摄食明显减少、倦怠、懒动、畏寒、毛发疏散不洁或竖毛等现象,与临床上脾虚证的症状较相似。学术界对评价证候模型的微观指标进行不懈研究并取得一定收获。王喜军等在研究六味地黄丸血中移形成分对氢化可的松致大鼠肾虚动物模型的保护作用时,采用皮下注射氢化可的松注射液制造大鼠肾阴虚模型,测定其微观指标如下:体质量、胸腺和脾脏重量、心率、血清超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathioneperoxidase,GSH-PX)活力,血浆黏度、血清一氧化氮(nitricoxide,NO)值、血清内皮素(endothelin,ET)值、血清睾酮(testosterone,T)值、雌二醇/睾酮(E2/T)值、血清游离甲状腺素(freethyroxine,FT4)、碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)值。任建勋等采用半高脂高糖饲料复合睡眠剥夺建立大鼠气虚血瘀证动物模型,测定凝血功能测定凝血酶原时间、活化部分凝血激酶时间、纤维蛋白原;血管活性分子测定血管紧张素Ⅱ、ET、血栓素B2(thromboxaneB2,TXB2)等微观指标。“以方测证”作为一种方法,最初主要应用于《伤寒论》和《金匮要略》方证条文的研究,主要根据方剂药味组成及其效用来推测其所主治对象的病机或症状。冉秋等将已经采用6-羟基多巴胺损毁注射法成功制作帕金森模型的SD大鼠分别灌饲桃红四物汤、涤痰汤和天麻钩藤饮,45d后发现天麻钩藤饮对帕金森病模型相关性和中医证候相关性的几个指标改善程度上远强于桃红四物汤和涤痰汤,据此认为其中医证候属性属于阴虚动风证。王文萍等首先建立慢性间歇性缺氧小鼠模型,每天同时灌服生脉散水提液,发现生脉散对模拟气阴两虚证的慢性缺氧小鼠自发活动、心电图等指标的异常改变改善作用显著,据此初步认定其中医证候属性属于气阴两虚证。生物代谢研究目前,缺乏客观量化指标是中医证候动物模型评价的最大挑战。将抽象的中医证候诊断与客观的量化指标相联系,是实现中医药现代化的必要途径。代谢组学作为系统生物学的重要组成部分,在方法学上具有无创、在体、动态等特点,与中医学诊治中整体动态性原则具有相似性。其研究过程包括样品制备,代谢产物分离、检测与鉴定,数据分析与模型建立3个部分,通过核磁共振(nuclearmagneticresonance,NMR)、液相色谱-质谱联用(liquidchromatography-massspectromery,LC-MS)、气相色谱-质谱联用(gaschromatography-massspectrometry,GC-MS)技术分析尿液、血浆或血清、唾液及细胞和组织的提取液等生物样品,结合模式识别、专家系统等分析方法,寻找生物标志物,研究相关代谢物变化涉及的代谢途径和变化规律,以阐述生物体对外界刺激的反应机制。代谢组学是生物体整体功能状态的“生化表现”,可以用来表征中医思想中的“诸内”,中医思想与代谢组学思想是“外与内”的结合。不同分析方法对失睡眠症潜在生物标志物的代谢组学研究近年来,国内已经有许多学者将代谢组学技术应用于中医证候动物模型研究中,通过分析生物样品,寻找中医证候的生物标记物。WangX等利用UPLC/HDMS对左冠状动脉结扎法制作的心气虚证大鼠尿液进行了代谢组学研究,检测尿液代谢轮廓,经主成分分析(principalcomponentanalysis,PCA)得心气虚组与空白组有显著差异,结合正交偏最小二乘判别分析方法(O-PLS-DA)找到17种潜在生物标志物,根据MS/MS碎片离子图及HDMB、MetPA等数据库对其进行结构鉴定和代谢通路分析。这些生物标志物与糖酵解或糖异生途径,不饱和脂肪酸、脂肪酸的生物合成,嘌呤代谢途径有关。给予温心方后,其中12种标志物回调至正常水平,证明了温心方治疗心气虚作用。PingWang等利用UPLC/HDMS对甲状腺素和利血平诱导的肾阴虚证大鼠尿液进行了代谢组学研究,找到20个潜在生物标志物,根据MS/MS碎片离子图鉴定其为尿酸、氨基脂肪、氨基葡萄糖等。给予六味地黄丸后,发现低剂量组与空白组代谢水平最为接近,为评价中药方剂提供新方法。XijunWang等利用UPLC/MS结合多变量分析方法对临床中黄疸病人的尿液进行代谢组学分析,发现并鉴定44个黄疸证生物标志物,包括β-Citryl-L-谷氨酸、二甲基鸟苷、吲哚谷氨酰胺等,同时鉴定40个阳黄亚型生物标志物及49个阴黄亚型生物标志物,该研究依据临床实验为动物模型的复制与评价提供方法。BoYang等运用UPLC/HDMS结合模式识别方法对果蝇进行代谢组学研究,分析鉴定20个失眠症潜在生物标志物,主要与氨基酸代谢和脂肪酸代谢相关联,并根据其改变揭示酸枣仁汤的作用机制。严蓓等运用GCTOF/MS法对心血瘀阻证与气阴两虚证心肌缺血大鼠模型进行代谢组学的表征与识别。血瘀组皮下注射盐酸肾上腺素,冰水冷刺激致血瘀模型;气阴两虚组剥夺睡眠致气血两虚模型。对各组血浆数据用PCA和最小二乘判别式分析进行降维,发现缬氨酸、2-氨基丁酸、甘氨酸等是区分两种病证的潜在生物标志物。为探索中医肝郁脾虚证的物质基础和分子生物学诊断指标,ZhangA等利用UPLC/HDMS结合多变量分析与通路分析筛选与肝郁脾虚证相关的4个生物标志物,即脯氨酰基羟脯氨酸,L-高半胱氨酸,2-辛醇肉碱和α-N-苯乙酰基-谷氨酰胺,此研究同时为动物模型复制提供依据。潘秋等运用GC-MS法对糖尿病大鼠脾气亏虚、痰瘀互阻证的尿液进行代谢组学分析,发现第6周模型组较空白组L-抗坏血酸、D-葡萄糖酸、丙氨酸、十八烷酸和戊二酸含量增加;与第3周相比,第6周模型组尿液中以上物质增加。根据以上几种代谢物的组合规律及含量变化,初步阐释糖尿病大鼠中医证候的相关代谢物特征。罗和古等运用1H-NMR法对肝郁脾虚大鼠模型的血浆进行代谢组学分析,寻找肝郁脾虚证候的潜在生物标记物。以慢性束缚方法制作肝郁脾虚模型,对正常组、模型组7d及21d大鼠的血浆1H-NMR谱进行PCA,发现醋酸、乳酸、酪氨酸等5种代谢物可作为肝郁脾虚证的生物标志物。刘志刚等运用HPLC-MS/MS法对肺气虚型大鼠模型的血浆进行代谢组学分析。以“COPD肺气虚证动物模型”复制法复合木瓜蛋白酶雾化吸入法复制COPD肺气虚证模型大鼠。通过对照组与模型组血浆代谢物的检测,发现代谢特征有明显区别,经鉴定精胺、双氢神经酰胺、十二烷二酰肉碱等10种变化显著的代谢物质,作为COPD肺气虚证潜在的疾病标志物。中医方证代谢组学研究的关键技术中医证候动物模型的建立与评价经历了长时间的发展,但现在仍处于探索阶段,并存在着许多问题和争议。主要源于证本质研究尚未完善,临床诊断信息无法应用于动物模型评价中。由于个体差异,相同的因素不一定会导致相同的证候;宏观表征主观性强,不能作为评价的唯一指标;学术界公认的证候客观指标并不多,缺乏特异性等,这些都成为阻碍中医证候动物模型发展的因素。代谢组学是一种采用系统生物学思路研究代谢小分子组的高通量分析方法,通过比较不同条件下的小分子代谢谱,找到具有意义的生物标志物,为客观评价中医证候模型提供了新的思路与依据,为实现中医药现代化起到推动作用。证本质研究又是证型规范化的前提与基础,是中西医两种医学体系深层次沟通的必由途径。所以深入地探索中医“证”的诊断或评价指标,尝试对其进行定性定量的表达研究,是中医证型规范化及建立中医疗效评价指标体系的关键途径,具有实际的临床应用价值。笔者认为利用代谢组学技术充分认识中医证候/病的生物学本质,确定证/病的生物标记物,以证/病的生物标记物为桥接复制与证/病关联的动物模型。建立中医方证代谢组学研究的关键技术,充分发挥代谢组学以体液中全部小分子代谢产物